潤肺膏對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ含量的影響

鄒愛玲，柳 新，于文瀟

（1.煙臺市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 煙臺 264670；2.煙臺渤海制藥集團(tuán)有限公司，山東 煙臺 264003）

潤肺膏對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ含量的影響

鄒愛玲1，柳 新2，于文瀟2

（1.煙臺市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 煙臺 264670；2.煙臺渤海制藥集團(tuán)有限公司，山東 煙臺 264003）

目的 觀察潤肺膏對哮喘模型大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）含量的影響，探討其可能的藥理作用機(jī)制。方法 制備炎性哮喘動物模型，利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測BALF中TNF-α和IFN-γ含量的變化。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠BALF中TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；IFN-γ的含量顯著降低（P＜0.01），與模型組大鼠比較，給予中、高劑量潤肺膏后，BALF中TNF-α的含量顯著降低（P＜0.01）；給予高劑量潤肺膏后，BALF中IFN-γ的含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論 潤肺膏具有平喘功能，其作用機(jī)制可能與抑制BALF中TNF-α的生成以及提高IFN-γ的含量有關(guān)。

潤肺膏；支氣管哮喘；BALF；TNF-α；IFN-γ

支氣管哮喘（bronchial asthma）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應(yīng)性、可逆性氣流受限，反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致氣道重塑，主要表現(xiàn)為上皮下膠原沉積、氣道平滑肌增殖、黏液腺增生以及血管再生等改變。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但多種細(xì)胞因子在哮喘的發(fā)病過程中起著十分重要的作用。TNF-α和IFN-γ作為重要的炎癥細(xì)胞因子都與哮喘病的發(fā)作密切相關(guān)[1-3]。潤肺膏是煙臺渤海制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的國內(nèi)獨(dú)家產(chǎn)品，主要由萊陽梨膏、黨參、黃芪、紫菀、百部、川貝母組成，具有潤肺益氣、止咳化痰之功效。本研究通過分子生物學(xué)的方法，觀察潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中TNF-α和IFN-γ含量的影響，進(jìn)一步探討潤肺膏的藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD種大鼠，雄性，體重（230±30）g，由山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SYXK（魯）20030020。

1.2 主要儀器及試劑

儀器：精密電子天平；TGL-臺式水平離心機(jī)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；酶標(biāo)儀；無菌注射器；霧化器；有機(jī)玻璃霧化箱（31 cm×31 cm×36 cm）。

試劑：潤肺膏，規(guī)格250g/瓶，煙臺渤海制藥集團(tuán)有限公司（批號130471）；雞卵白蛋白；氫氧化鋁干粉；定喘止嗽丸（北京同仁堂天然藥物有限公司，批號13030004），TNF-α、IFN-γ的ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號A07061406）

1.3 動物模型制備[4-5]

選取體重在200～260 g健康雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為正常組（生理鹽水），模型對照組（生理鹽水），潤肺膏低（2 g/kg）、中（4 g/kg）、高（8 g/kg）劑量組，陽性藥（定喘止嗽丸，2 g/kg）組，每組12只，各組均給予相同飼育條件。除正常組外，其余各組分別于第1天和第8天腹腔各注射含1 mg雞卵白蛋白和100 mg氫氧化鋁凝膠生理鹽水注射液1 mL，從第15天開始用1%雞卵白蛋白6 mL霧化吸入，每天1次，每次20 min，持續(xù)至第44天。正常組依照上述方法，以相同劑量生理鹽水代替腹腔注射和霧化吸入。

1.4 BALF的收集

結(jié)扎右側(cè)肺門，行左支氣管肺泡灌洗。經(jīng)右支氣管插管將4℃生理鹽水2 mL緩慢注入右肺中，在肺內(nèi)停留30秒后吸出，反復(fù)沖洗3遍。回收灌洗液于4℃，1000 r/min，離心10 min，取上清液-80℃保存待檢。

1.5 BALF中TNF-α、IFN-γ含量的測定

依據(jù)ELISA試劑盒所述方法，測定TNF-α及IFN-γ的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，利用spss10.0統(tǒng)計軟件處理。存活率的比較用卡方檢驗(yàn)，其余各組數(shù)據(jù)之間采one-way ANOVA法方差分析，方差不齊時采用Dunnett’c方法作多重比較。P＞0.05為統(tǒng)計學(xué)無顯著差異，P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 潤肺膏對動物行為的影響

各組大鼠行為學(xué)觀察，模型組及各給藥組在第1次激發(fā)后均可見呼吸加深加快、點(diǎn)頭運(yùn)動、腹肌收縮等喘息癥狀，及抓撓口鼻、口唇紫紺、扭體等表現(xiàn)，模型組的癥狀表現(xiàn)較其他各組嚴(yán)重；正常對照組無上述癥狀出現(xiàn)。

2.2 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中TNF-α含量的影響

與正常組比較，哮喘模型大鼠BALF中TNF-α的含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，潤肺膏中、高劑量組均能有效地減少BALF中TNF-α的含量（P＜0.01）。見圖1。

圖1 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中TNF-α含量的影響注：與正常組比較，++P＜0.01有極顯著性差異；與模型組比較，**P＜0.01有極顯著性差異；*P＜0.05有顯著性差異

2.3 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中IFN-γ含量的影響

與正常組比較，哮喘模型大鼠BALF中IFN-γ的含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，潤肺膏高劑量組和陽性藥組均能有效地升高BALF中IFN-γ的含量（P＜0.05）。見圖2。

圖2 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中IFN-γ含量的影響注：與正常組比較，++P＜0.01有極顯著性差異；與模型組比較，**P＜0.01有極顯著性差異；*P＜0.05有顯著性差異

3 討 論

隨著生活壓力的增大以及大氣污染的加重，哮喘的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量。哮喘的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，有研究表明[2]，其發(fā)病機(jī)制為嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與引起的特異性的慢性氣道炎癥，其發(fā)病過程是多個細(xì)胞因子、多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)相互聯(lián)系并相互作用而導(dǎo)致的。

TNF-α是一種可由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的前炎癥細(xì)胞因子，是哮喘病發(fā)病過程中的重要因素。在體內(nèi)，高水平的TNF-α慢性刺激和釋放可引起組織免疫病理損傷及炎癥介質(zhì)的瀑布樣連鎖反應(yīng)，最終引起氣道痙攣，使血管通透性增加、微血栓形成、氣道粘膜水腫等，從而導(dǎo)致哮喘發(fā)作[6]。研究表明，支氣管哮喘患兒急性發(fā)作期血清TNF-α水平升高，且與其預(yù)后有相關(guān)性，說明TNF-α的含量變化在哮喘的發(fā)病過程中具有重要作用[7]。IFN-γ是種氣道炎性的介質(zhì)，能引發(fā)氣道中的上皮細(xì)胞脫落，免疫調(diào)節(jié)活性比較強(qiáng)，IFN-γ減少是變應(yīng)性疾病危險的因素[3]。IFN-γ和白介素-4（IL-4）的不平衡是哮喘的一個主要特征，也是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡是哮喘治療的重要靶點(diǎn)[8]。

潤肺膏處方以萊陽梨清膏為主藥，潤肺生津，配以黨參，黃芪補(bǔ)中益氣，氣旺則痰行水消；另外加以紫菀、百部、川貝母、滋潤補(bǔ)肺，肺潤則咳止，以上諸藥配伍，既有協(xié)同作用，又能增強(qiáng)療效。臨床上治療咳嗽、哮喘、慢性支氣管炎等癥具有明顯的治療效果。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，哮喘模型大鼠的BALF中TNF-α的含量較正常組具有明顯升高，IFN-γ的含量顯著降低，給予潤肺膏干預(yù)后，其含量均有顯著改善，說明 TNF-α和IFN-γ與哮喘的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，并且可能是潤肺膏平喘作用的靶點(diǎn)之一。具有的作用機(jī)制雖然還不十分清楚，今后仍需作進(jìn)一步研究，但這為潤肺膏的藥理機(jī)制研究提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] RubiraGarcia N.Tunor necrosis factor[J].Allergol Immunopathol( Madr),2000,28(3):115.

[2] 李學(xué)良,許朝霞,王憶勤.支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(9):1960.

[3] 王華巧.IL-4、IFN-γ、和TGF-β1在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)學(xué),2014,35(18):4047.

[4] 袁益明,王曾禮,劉小菁,等.基質(zhì)金屬蛋白酶在哮喘大鼠氣道結(jié)構(gòu)重建中的作用[J].中華內(nèi)科雜志,2001,40:700.

[5] 李昌崇,胡曉光,陳小芳,等.牛膝多糖對幼年哮喘大鼠模型氣道炎癥的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003,26:644.

[6] 胡 賓.支氣管哮喘患兒血清TNF-α、IL-6水平及其臨床意義[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2010,23(7):812.

[7] 吳紅梅,于 瑩,張 莉,等.支氣管哮喘患兒血清總IgE、TNF-α檢測及其臨床意義[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(8):1244-1246.

[8] 張 琦,董 亮,李麗珍,等.以T2bet/GATA23的比率作為評價哮喘患者Th1/Th2失衡指標(biāo)的探討[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2005,21(1):118-119.

本文編輯：吳玲麗

R526.25

B

ISSN.2095-8242.2017.16.2975.02