兔骨髓間充質干細胞聯合無機誘導因子支架修復兔脛骨缺損實驗研究

徐 林，葉 川，潘汝南，李忠輝，李琦哲，王駿華，熊建斌，范建楠*

（1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學附屬醫院骨科，貴州 貴陽 550004；3.四川省骨科醫院，四川 成都 610041）

兔骨髓間充質干細胞聯合無機誘導因子支架修復兔脛骨缺損實驗研究

徐 林1，葉 川2，潘汝南3，李忠輝1，李琦哲1，王駿華1，熊建斌2，范建楠2*

（1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學附屬醫院骨科，貴州 貴陽 550004；3.四川省骨科醫院，四川 成都 610041）

目的 對兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）聯合無機誘導因子支架修復兔脛骨缺損進行分析研究。方法 將36只新西蘭大白兔隨機分為三組，A組（空白組），B組（對照組）、C組（實驗組），各12只。在兔雙側脛骨制備直徑為6 mm的骨缺損區域。A組不做任何處理，B組單純植入支架，C組植入支架與細胞的復合物。分別于4 w、8 w、12 w、16 w行一般情況、X線及骨密度檢查。結果 術后各組進食均正常，切口愈合良好。術后A組第12 w無修復跡象；B組第4 w、8 w骨缺損部分修復，12 w骨缺損完全修復；C組各時間點骨缺損修復和骨痂生長情況顯著優于B組；C組術后4 w、8 w、12 w時各缺損區的骨密度顯著高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組16 w骨密度比較無明顯差異，差異無統計學意義（P＞0.05）。X線顯示，B組術后12 w缺損區基本修復。C組術后4 w缺損區可見骨痂生長，8 w骨缺損基本修復。結論 兔骨髓間充質干細胞聯合無機誘導因子支架體外復合培養構建組織工程骨修復骨缺損的能力較單純植入支架強且迅速。

骨缺損；兔骨髓間充質干細胞；無機誘導因子支架

近年來，組織工程骨技術取得了迅猛的發展，骨髓間充質干細胞被公認為理想的種子細胞來源之一，其多向分化潛能和向成骨細胞定向誘導分化的優勢已取得實驗室的基本共識。骨缺損是臨床常見病癥，其治療一直是骨科難題，自體骨移植、異體骨移植以及人工骨移植均為骨缺損的常用治療方式，但它們均存在自身難以克服的缺點。目前，已有研究證實，將骨髓間充質干細胞與人工合成骨復合成組織工程骨有助于促進骨修復。本文對兔骨髓間充質干細胞復合無機誘導因子支架修復兔脛骨缺損進行分析研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康清潔級新西蘭大白兔36只，4月齡，體重（2.5±0.3）kg，雌雄各半，購自昆明醫科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（滇）k2015-0002，A組（空白組），B組（對照組）、C組（實驗組），各12只。相同條件下分籠飼養一周以適應環境。材料：奧邦骨修復材料（江蘇陽生生物工程有限公司）、全培養基（GIBCO公司）、胰蛋白酶。

1.2 方法

1.2.1 BMSC提取、分離及培養

無菌操作下將每只實驗組兔子麻醉，用帶有骨穿針的注射器在每只兔子的脛骨結節下抽取骨髓液3～5 mL，添加300 U肝素抗凝。與淋巴細胞分離液混合，密度梯度離心，吸取上層細胞層，800 r/min離心6 min，棄上清后加入全培養基，接種于培養皿內，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育，當細胞生長至80%融合時傳代培養。

1.2.2 細胞與支架復合

將無機誘導因子支架經紫外線照射后，放置于全培養基中預濕24 h，PBS沖洗5次，5min/次，吸出多余液體，放入24孔板中備用。收集生長良好的第3代BMSCs，0.25%胰酶消化后，1500 r/min離心5 min，棄上清，調整細胞濃度為5.0×106/mL，將細胞懸液均勻接種在預處理的支架上，液面稍覆蓋支架材料表面，即形成細胞-支架復合物。接種后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育3 h，3 h后緩慢加入成骨誘導液，每兩天換液一次。一周后BMSCs即可與支架復合。

術后4 w、8 w、12 w、16 w周行骨密度及X光攝片。術后4 w、8 w、12 w、16 w每組各處死3只兔子取出標本，觀察三組骨缺損修復情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗；計數資料以例數（n）、百分數（%）表示，采用x2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組兔術后一般情況

術后各組進食均正常，術后1天可站立，有輕微跛行。術后2 w能自由活動。愈合良好。術后空白組12 w無修復跡象；對照組8 w、12 w骨缺損部分修復，16 w骨缺損完全修復，實驗組各個時間點骨缺損修復和骨痂生長情況顯著優于對照組。

2.2 不同時間點兩組骨密度的對比

實驗組術后4 w、8 w、12 w時各缺損區的骨密度顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組16 w骨密度比較無明顯差異，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同時間點兩組骨密度的對比（±s）

表1 不同時間點兩組骨密度的對比（±s）

組別術后4 w術后8 w術后12 w術后16 w實驗組0.919±0.0421.241±0.0221.652±0.0691.712±0.081對照組0.569±0.0201.001±0.0311.149±0.0281.565±0.072

2.3 兩組X線片對比

空白組：術后12 w未見明顯骨痂形成。

對照組：術后4 w見少量骨痂形成；術后8 w見中等量骨痂形成，但缺損區仍明顯易分辨；術后可見12 w大量骨痂形成，缺損區表現為模糊骨痂影；術后16 w缺損區基本修復。

實驗組：術后4 w缺損區見中等量骨痂。術后8 w可見密度增高的骨痂影充填，缺損區基本修復，12 w缺損區塑型良好，皮質連續，缺損區不易分辨。

3 結 論

結論:兔骨髓間充質干細胞聯合無機誘導因子支架體外復合培養可用來構建組織工程骨，修復骨缺損的能力較單純植入支架強且迅速。

4 討 論

本組研究中對MSCs聯合無機因子支架修復兔脛骨缺損進行分析研究。將植入支架與細胞復合物、單純植入支架與不植入支架的脛骨缺損修復情況進行了對比分析。結果顯示，術后空白組12 w無修復跡象；對照組8 w、12 w骨缺損部分修復，16 w骨缺損完全修復，說明無機因子支架材料對骨缺損的修復具有促進作用。實驗組術后4 w、8 w、12 w時各缺損區的骨密度顯著高于對照組，兩組16 w骨密度比較無明顯差異，說明骨髓間充質干細胞復合支架修復骨缺損效果比單純植入支架明顯。X線顯示，空白組術后12 w骨缺損區無修復跡象；對照組術后12 w缺損區基本修復，實驗組術后4 w缺損區可見骨痂生長，8 w骨缺損基本修復。因而我們認為，兔骨髓間充質干細胞聯合無機因子支架體外復合培養可用來構建組織工程骨，修復骨缺損的能力優于單純植入支架。

[1] 王之允,董長和,楊敏云,等.兔骨髓間充質干細胞復合生物衍生骨修復脛骨缺損[J].中國臨床康復,2006,10(13):76-78.

[2] 孫 勇,肖建德.血管內皮生長因子在骨組織工程中的應用[J].國際骨科學雜志,2007,28(6):393-397.

[3] 劉順振,侯玉東.骨組織工程支架材料的研究進展及臨床應用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2011,15(42):7911-7914.

[4] 李東亞,鄭 欣,陳一心,等.骨組織工程支架材料應用于大段骨缺損的實驗研究進展[J].創傷外科雜志,2013,15(1):87-90.

本文編輯：趙小龍

R68

B

ISSN.2095-8242.2017.21.3977.02

范建楠