骨疏顆粒對去勢雌性大鼠骨關節炎的影響觀察

李 冰 杜義斌

(云南省中醫醫院， 昆明 650021)

骨疏顆粒對去勢雌性大鼠骨關節炎的影響觀察

李 冰 杜義斌

(云南省中醫醫院， 昆明 650021)

觀察骨疏顆粒對去勢雌性大鼠骨關節炎模型的性激素、炎性因子影響，以及骨疏顆粒治療去勢后雌性大鼠骨關節炎的療效．將60只SD大鼠隨機分為4組：模型組、正常對照組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組．采用卵巢摘除聯合過度運動制作骨關節炎模型，觀察大鼠性激素、炎性因子改變．結果表明，與模型組比較，骨疏顆粒組及雌激素組均可以改善去勢雌性大鼠性激素、炎性因子水平(P<0.01或P<0.05)，二者之間無顯著差異(P>0.05)．骨疏顆粒能治療和延緩去勢雌性大鼠骨關節炎病變，與戊酸雌二醇無顯著性差異．

骨關節炎； 骨疏顆粒； IL-1； IL-6； TNF-α； 實驗研究

骨性關節炎(osteoarthritis， OA)是一種慢性退行性關節疾病，多見于中老年人，且女性多于男性，特別是絕經后婦女[1].中醫認為腎為先天之本，脾胃為后天之本，氣血生化之源，骨性關節炎的病機為腎氣虛衰，脾失健運，脈絡瘀阻．中醫治療骨性關節炎的主要方法就是補腎健脾活血，本實驗研究觀察補腎健脾活血方骨疏顆粒對去勢雌性大鼠骨關節炎模型的影響．

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選擇8月齡SD雌性未孕大鼠60只，體重在250±50 g之間．由昆明醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號:SCXK(滇)2011-0004．在昆明醫科大學動物實驗中心實驗室飼養，實驗室室溫18～22℃．隨機分為4個組，分別為戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組、正常對照組、模型組．

1.2 藥品、試劑與儀器

1)藥品．骨疏顆粒由狗脊、淫羊藿、炙黃芪、骨碎補、白術、熟地、三七、杜仲、陳皮、獨活等組成，生藥由云南中醫醫院制劑中心提供，并配制成顆粒劑．骨疏顆粒每袋重15 g(生藥)，用蒸餾水按8.6 g/kg配制成2.5 mL藥液灌胃．戊酸雌二醇(拜耳醫藥保健有限公司，1 mg*21片/盒，批號：095C)按0.1 mg/kg用蒸餾水配成2.5 mL溶液．本實驗骨疏顆粒的用量為人正常用量的10倍．確定此用量是基于預實驗中去勢雌性大鼠骨關節炎出現變化的治療劑量．

2)試劑．雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)、催乳激素(PRL)、卵泡生成激素(FSH)、黃體生成激素(LH)放射免疫試劑盒，由天津九鼎醫學生物工程有限公司提供．生化指標試劑盒為武漢優爾生科技股份有限公司生產：IL-1，IL-6，TNF．使用ELISA法檢測．

3)儀器．石蠟切片機(德國比CIA公司生產)，石蠟切片機刀片(德國ELICA公司產品)，組織貼片機(YT-6B湖北孝感亞光醫用電子技術研究所)，包埋機(SHANDON)電熱恒溫T燥箱(上海躍進醫療器械廠)，普通光鏡(尼康NIKONE200日本)放大倍數(×20)．

1.3 實驗方法

1)造模方法．8月齡SD雌性大鼠60只，以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，以最末肋骨所對應之椎體為中點做背部正中縱行切口，向兩側牽拉切口，分別于脊柱兩側切開肌層，顯露兩側腎臟，于其下找到卵巢并切除，止血后縫合切口．卵巢送病理切片確定切除完整．正常對照組大鼠步驟同前，切除卵巢旁部分脂肪，不切除卵巢．考慮動物可能有死亡，各組多備2只大鼠，確保實驗分組均為15只，術后3 d內每日給予80萬單位青霉素肌注預防感染，分籠飼養，在(24±2)℃、通風良好、濕度60%～70%的實驗條件下標準鼠飼料喂養，自由攝水．切口愈合后將動物置于電動滾輪上，驅使動物行走，10 min/次，2次/d．

2)給藥方法．在大鼠接受造模處理12周后，開始進行藥物的灌胃．空白對照組和模型組大鼠各自灌服2.5 mL生理鹽水．戊酸雌二醇組和骨疏顆粒組大鼠稱重，灌服配置藥液2.5 mL，分別于第4周、第8周、第16周結束時，每組隨機處死5只大鼠取血及關節液標本．

3)觀察指標及檢測方法．于用藥后第4、第8、第16周3個時相點測定關節液中IL-1、IL-6及TNF-α含量及血清性激素水平(ELISA法)．觀察大鼠左膝關節病理切片變化．

2 結 果

造模的60只雌性大鼠，傷口均愈合良好，無感染、出血、潰瘍等情況．造模后第2～3 d，大鼠進食、飲水均較術前減少，大便稀軟；造模12周后存活的大鼠未見明顯異常，灌胃期間模型組大鼠精神略顯差，體毛干枯不齊，其余各組表現不明顯．

2.1 各組大鼠血清性激素水平的比較

與正常對照組比較，模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組E2水平有明顯降低(P<0.01)，表明造模成功．組間比較，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組與模型組比較E2水平有明顯升高(P<0.01)，但未達到正常水平．戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組之間無明顯差異(P>0.05)．與正常對照組比較，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組T水平降低(P<0.05)．戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組無明顯差異(P>0.05)．與正常對照組比較，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組P，PRL水平降低(P<0.05，P<0.01)，骨疏顆粒組較戊酸雌二醇組降低(P<0.05)，與模型組無明顯差異(P>0.05)．LH，FSH水平4組之間無明顯差異(P>0.05)(見表1)．

2.2 各組大鼠膝關節液IL-1β水平的第4、8、16周比較

第4周戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組無明顯差異(P>0.05)，模型組較戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組升高(P<0.05)，與正常對照組無明顯差異．在第8、16周僅雌二醇組低于正常對照組(P<0.05)；骨疏顆粒組與戊酸雌二醇組之間無明顯差異(P>0.05)(見表2).2.3 各組大鼠膝關節液IL-6水平的第4、8、16周比較

第4周骨疏顆粒組明顯低于其他三組(P<0.05)，在第8、16周雌二醇組低于骨疏顆粒組(P<0.05)，均未達到正常對照組水平(見表3).

2.4 各組大鼠膝關節液TNF-α水平的第4周、8周、16周比較

骨疏顆粒組明顯低于其他三組(P<0.05)(見表4).

表1 各組第16周大鼠血清性激素水平比較

注：各組平均數間，凡有一個相同標記字母的即為差異不顯著，凡具不同標記字母的即為差異顯著．

表2 各組大鼠膝關節液IL-1β水平的第4周、8周、16周比較

注：各組平均數間，凡有一個相同標記字母的即為差異不顯著，凡具不同標記字母的即為差異顯著．

表3 各組大鼠膝關節液IL-6水平的第4周、8周、16周比較

注：各組平均數間，凡有一個相同標記字母的即為差異不顯著，凡具不同標記字母的即為差異顯著．

表4 各組大鼠膝關節液TNF-α水平的第4周、8周、16周比較

注：各組平均數間，凡有一個相同標記字母的即為差異不顯著，凡具不同標記字母的即為差異顯著．

2.5 各組大鼠膝關節滑膜病理改變

如圖1所示，骨疏顆粒組的關節軟骨細胞有明顯的成團聚集趨勢，修復關節軟骨．正常對照組關節滑膜上皮細胞明顯增生，細胞漿增多，無炎癥．戊酸雌二醇組關節滑膜上皮細胞增生，粘膜層有少量脂肪，無炎癥．骨疏顆粒組關節滑膜上皮細胞呈明顯增生，無炎癥．對照組關節滑膜上皮細胞呈單層，粘膜層有多量脂肪，無炎癥．

圖1 大鼠膝關節滑膜病理改變(×20，HE)

2.6 各組大鼠膝關節滑膜及軟骨病理改變

如圖2所示，正常對照組關節軟骨細胞有成團聚集趨勢，細胞肥大，胞核增大，使關節面不平滑．戊酸雌二醇組關節軟骨細胞有成團聚集趨勢，細胞肥大，胞核增大，使關節面不平滑．骨疏組節軟骨細胞有成團聚集趨勢，細胞肥大，胞漿增多，胞核增大，使關節面不平滑．對照組關節軟骨細胞有成束聚集，軟骨中有鈣鹽沉積灶．

圖2 大鼠膝關節軟骨病理改變(×20，HE)

3 討 論

在OA的多種致病因素中，比較重要的是炎性細胞產生的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α．炎性因子可導致關節腔內的炎性反應，消耗和破壞軟骨，使骨質裸露，引起關節失去正常結構及功能[2]．其中IL-1β不僅促進透明軟骨型膠原的降解，還促進纖維軟骨型膠原的增生，是直接介導軟骨破壞的細胞因子之一[3]．IL-6主要通過促進淋巴細胞分泌免疫球蛋白，從而導致關節和滑膜炎癥的加重，軟骨基質缺失[4]．TNF-α能使軟骨蛋白多糖降解和合成減少，致關節軟骨損害及骨質破壞，關節強直[5]．王樂平等[6]認為與骨關節炎發病相關的炎性因子如白細胞介素1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF-α)是引起軟骨分解的主要機制．

絕經期婦女雌激素水平明顯降低，相關炎癥因子明顯增高，骨關節炎的發病率升高[1]，雌激素替代療法可以降低炎癥因子水平，降低絕經后婦女骨關節炎發病率，改善關節炎癥狀[7-8]，但雌激素的副作用使其應用受到了限制．骨關節炎在中醫辨證屬于“痹癥”的范疇，其病機主要為婦女絕經后腎精不足，脾失健運，脈絡瘀阻．故而絕經期婦女骨關節炎應以補腎健脾、活血化瘀為治法．骨疏顆粒是云南省中醫醫老年科院治療絕經期婦女的骨關節炎驗方，主要由狗脊、骨碎補、淫羊藿、炙黃芪、白術、熟地、三七、杜仲、陳皮、獨活等藥物組成的．驗方中君藥為狗脊、淫羊藿有益氣力，強志，堅筋骨，元陽振作之功；骨碎補、杜仲、熟地為臣藥，補肝腎強筋骨，助狗脊、淫羊藿以增強補腎之功；黃芪、白術、陳皮為佐藥，健脾以養后天并兼有祛痰除濕之功；羌活、獨活為使藥，養血生精活血，通絡定痛．在臨床上，骨疏顆粒治療婦女絕經期骨質疏松有良好的療效[9-11]，通過動物實驗發現骨疏顆粒可升高去勢雌性大鼠雌激素的水平[11]．

本實驗切除雌性大鼠雙側卵巢16周后，戊酸雌二醇組和骨疏顆粒組的E2水平接近正常，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組T、P水平明顯降低．戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組、正常對照組PRL、LH水平相似．FSH在4組之間無明顯差異．戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組、正常對照組大鼠膝關節液IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組(P<0.05)，骨疏顆粒組大鼠膝關節液TNF-α水平明顯低于其他三組．

骨疏顆粒通過升高雌激素水平，降低炎性因子水平，減輕去勢大鼠骨關節炎的炎癥反應，與戊酸雌二醇相比，骨疏顆粒對于關節軟骨的修復作用更佳．本實驗另外一個發現，骨疏顆粒并未提高睪酮的水平，骨疏顆粒含有狗脊、淫羊藿、骨碎補，在多個實驗研究中均提示淫羊藿、狗脊、骨碎補含有黃酮類化合物[12-14]，對雄性大鼠有升高雄激素的作用[15]，對骨質疏松、骨關節炎具有良好的治療作用，但是本實驗雌性大鼠的睪酮水平降低，提示骨疏顆粒并非通過影響去勢雌性大鼠體內雄激素水平來治療骨關節炎．

[1] 呂厚山，孫鐵錚，劉忠厚．骨關節炎的診治與研究進展[J]．中國骨質疏松雜志，2004，10(1)：7-22．

[2] 燕 軍，節曉光，孟 江．苗藥榮筋湯治療兔KOAIL-1β、TNF-α水平觀測[J]．中國中醫骨傷科雜志，2009，17(7)：5-6．

[3] Pelletier J P， DiBattista J A， Roughley P， et al． Cytokines and inflame mation in cartilage degradation[J]． Rheum Dis Clin North Am， 1993， 19 ：545-568．

[4] 張永亮，宓軼群，剛嘉鴻，等．細胞因子與針灸治療膝骨關節炎：實驗與應用[J]．中國組織工程研究，2014，18(24):3906-3911．

[5] Oegema Trhr， Lewis J L， Thompson R C Jr． Role of Acute Main Development of Osteoarthritis[J]． Agents Actions， 1993， 40(3/4)：220．

[6] 王平樂，董秋梅．中醫藥治療骨關節炎機制研究進展[J]．貴陽中醫學院學報，2009，31(6)：73-76．

[7] 郭欣宇，馬 英，曾 艷，等．絕經期骨性關節炎患者血漿性激素和細胞因子水平及其與膝關節功能的相關性[J]．中國全科醫學，11(5B)：852-854．

[8] 高 峰，杜 寧．雌激素受體與骨性關節炎[J]．醫學綜述，2008，14(1):33-35．

[9] 劉慧萍，陳明輝，李 玲，等．補腎活血方含藥血清對卵巢顆粒細胞ActA/Smads信號通路的影響[J]．時珍國醫國藥，2016，27(12):2857-2861．

[9] 杜義斌，徐翔峰，彭江云．骨疏顆粒治療老年女性骨質疏松癥30例療效觀察[J]．云南中醫中藥雜志，2006，27(5)：15．

[10] 杜義斌，吳 洋，段艷蕊，等．骨疏顆粒治療絕經后骨質疏松癥臨床觀察[J]．新中醫，2013，45(8)：18-21．

[11] 李 冰，杜義斌，李黔云，等．骨疏顆粒對去卵巢雌性大鼠骨質疏松的影響[J]．云南中醫學院學報，2014，37(4)：9-12．

[12] 蔣 俊，崔 莉，孫 娥，等．基于淫羊藿黃酮類化合物的體內代謝闡述其抗骨質疏松藥效物質基礎[J]．中草藥，2014，45(5)：721-729．

[13] 楊慧潔，吳 琦，楊世海．金毛狗脊化學成分與藥理活性研究進展[J]．中國實驗方劑學雜志，2010，16(15)：230-234．

[14] 劉玲玲，曲 瑋，梁敬鈺．骨碎補化學成分和藥理作用研究進展[J]．海峽藥學，2012，24(1)：4-9．

[15] 鄭 娟，徐思凡，劉慶山．植物藥黃酮類成分對睪丸功能的影響[J]．遼寧中醫藥大學學報，2009，11(3)：39-41．

[責任編輯 周文凱]

水利與環境學院魚類過壩技術博士生國際學術交流會在我校舉行

2017年4月21日，南安普頓大學博士生、三峽大學水利與環境學院來華留學博士生在我校水利與環境學院水電樓學術報告廳舉辦了水利與環境學院魚類過壩技術博士生國際學術交流會。就魚類過壩相關技術、水環境與水資源保護等相關內容進行學術研討，包括過魚設施簡介及設計水力學要求、魚類游泳與魚道設計、過魚設施效果監測與評價、河道修復與環境保護、水資源利用與保護等相關內容。

(轉載自三峽大學校園網)

Experimental Study of Effects of Gushu Granules on Osteoarthritis of Ovariectomized Osteoporotic Model Rats

Li Bing Du Yibin

(Yunnan Provincial College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650021，China)

Objective To investigate the effect of Gushu granules on osteoarthritis ovariectomized osteoporotic model rats. In order to provide experimental basis for clinical application of Gushu granules and further study. 60 SD rats were randomly divided into 4 groups i.e. model group, normal control group, estrogen group and group of Gushu granules. The osteoporosis model was induced by ovariectomy and overexercise. the change of sex hormone and inflammatory factor in rads were observed after the rats were treated with Gushu granules and estradiol valerate. The experimental results show Gushu granules and estradiol valerate could increase the level of sex hormone and reduce inflammatory factor of osteoarthritis model rats(P<0.01 orP<0.05). Significant difference is compared with model group (P<0.05). There is no significant difference between the two(P>0.05). It is concluded that the Gushu granules could treatment and delay osteoarthritis. There is no significant difference with estradiol valerate.

osteoarthritis; Gushu granules; IL-1; IL-6; TNF-α; experimental study

2017-03-21

云南省教育廳科學研究基金項目(課題號：2014Z124)；云南省衛生科技計劃項目(課題號：2014NS334)

李 冰(1974-)，女，主治醫師，主要從事老年病的中醫藥防治研究．E-mail：dybys@126.com

10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2017.03.024

R285.5

A

1672-948X(2017)03-0108-05