消喘貼敷膏劑質量標準研究

王友鳳，曹云飛，白小英

(1.山東中醫藥大學 山東 濟南 250355； 2.莒縣人民醫院 山東日照 276500；3.青島市海慈醫療集團 山東 青島 266033 )

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【中藥與天然活性產物】

消喘貼敷膏劑質量標準研究

王友鳳1，曹云飛2，白小英3*

(1.山東中醫藥大學 山東 濟南 250355； 2.莒縣人民醫院 山東日照 276500；3.青島市海慈醫療集團 山東 青島 266033 )

為建立消喘貼敷膏劑的質量控制方法，本文采用薄層色譜法對消喘貼敷膏劑中的白芥子、延胡索、細辛、蓽茇進行定性分析。采用高效液相色譜法對白芥子的芥子堿硫氰酸鹽進行含量測定，色譜柱為Phenomenex Geminin C18色譜柱(150 mm×4.6 mm ，5 μm)，以乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87，V/V)為流動相，檢測波長326 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μL。鑒定結果表明，4味中藥斑點清晰，分離較好，陰性對照無干擾。芥子堿硫氰酸鹽在0.84～8.4 μg范圍內呈良好的線性關系(r=0.999 7)，平均加樣回收率(n=6)為99.58 %(相對標準偏差為0.37 %)。該方法簡單快捷、準確可靠，專屬性強，可用于消喘貼敷膏劑的質量控制。

消喘貼敷膏劑；薄層色譜法；高效液相色譜法；芥子堿硫氰酸鹽；質量標準

消喘貼敷膏劑是按照傳統中醫理論組方并結合現代工藝加工制成的凝膠貼膏劑，由白芥子、延胡索、細辛、蓽茇4味中藥的超微粉與適宜的基質制備而成，具有溫肺化痰、散寒止痛、行氣通絡之功，主要用于支氣管哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、慢性咳嗽等。目前沒有對該制劑質量標準進行研究的文獻報導，為了對該制劑的安全性和有效性進行控制，參照《中國藥典》2015年版一部及相關文獻對其質量標準進行研究。本研究利用薄層色譜法對消喘貼敷膏劑中的白芥子、延胡索、細辛、蓽茇進行定性鑒別，同時采用高效液相色譜法對處方中君藥白芥子的主要藥效成分芥子堿硫氰酸鹽進行含量測定，該方法簡便、準確、專屬性強、重復性好，可作為控制消喘貼敷膏劑質量的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；KQ100 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JA2003型電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；Buchi R215V 型旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；HHW-4 型雙顯恒溫水浴鍋( 金壇市雙捷實驗儀器廠)；硅膠G預制薄層板( 德國MN公司，批號 707183)。

白芥子對照藥材(批號121150-200502)、延胡索對照藥材(批號120928-201208)、細辛對照藥材(批號121204-201405)、蓽茇對照藥材(批號121023-201103)、芥子堿硫氰酸鹽對照品(批號11702-201504)、延胡索乙素對照品( 批號 110726-201515)、細辛脂素對照品(批號111889-201504)、胡椒堿對照品( 批號111889-201504)(中國食品藥品檢定研究院),消喘貼敷膏劑(青島海慈醫療集團制劑室),甲醇(色譜純)、水(超純水)、其他試劑(分析純)。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 白芥子的鑒別

參照文獻[1-3]的方法，取本品2片，剪碎，加入30 mL甲醇，超聲波處理1 h，濾過，濾液蒸干，加甲醇2 mL使殘渣溶解，作供試品溶液。取白芥子對照藥材1 g加甲醇30 mL，同樣方法制得對照藥材溶液。另取芥子堿硫氰酸鹽對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。取處方中除去白芥子的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺白芥子的陰性對照品，同供試品制備方法制成陰性對照品溶液。分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液與陰性對照品溶液各10 μL，點于同一硅膠 G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(3.5∶5∶1∶0.5，V/V)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液在相應位置上無干擾 ( 見圖 1)。

2.1.2 延胡索的鑒別

參照文獻[4-5]的方法，取本品2片，剪碎，加濃氨試液1 mL與三氯甲烷20 mL，浸漬1 h，超聲波處理30 min，濾過，濾液蒸干，用甲醇1 mL使殘渣溶解，濾過，濾液作供試品。取延胡索對照藥材1 g加濃氨試液1 mL與三氯甲烷20 mL，同供試品制備方法制得對照藥材溶液。另取延胡索乙素對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。取處方中除去延胡索的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺延胡索的陰性對照品，同樣方法法制成陰性對照品溶液。分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液各4 μL，對照品溶液1 μL，點于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶2，V/V)為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中約 5 min后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈( 365 nm) 下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液在相應位置上無干擾 (見圖 2)。

1～3 供試品溶液;4 芥子對照藥材溶液;5 芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液;6 陰性供試品溶液。圖1 白芥子薄層色譜圖Fig.1 TLC of Sinapis semenc

1～3 供試品溶液；4 延胡索對照藥材溶液；5 延胡索乙素對照品溶液；6 陰性供試品溶液。圖2 延胡索薄層色譜圖Fig.2 TLC of orgdalis rhizoma

2.1.3 細辛的鑒別

參照文獻[6]的方法，取細辛對照藥材0.5 g加甲醇30 mL，同供試品制備方法制得對照藥材溶液。另取細辛脂素對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。取處方中除去細辛的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺細辛的陰性對照品，同供試品法制成陰性對照品溶液。分別吸取2.1.1項下白芥子供試品溶液以及上述對照藥材溶液與對照品溶液、陰性對照品溶液各3 μL，點于同一硅膠 G 薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1，V/V)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%(g/mL)香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至顯色清楚。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液在相應位置上無干擾 (見圖 3)。

2.1.4 蓽茇的鑒別

參照文獻[7-8]的方法，取蓽茇對照藥材0.5 g加甲醇30 mL，同供試品制備方法制得對照藥材溶液。另取胡椒堿對照品，加甲醇制成1 mL含4 mg的溶液，作為對照品溶液。取處方中除去蓽茇的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺蓽茇的陰性對照品，同供試品法制成陰性對照品溶液。分別吸取2.1.1項下白芥子供試品溶液以及上述對照藥材溶液與對照品溶液、陰性對照品溶液各2 μL ，點于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7∶2∶1，V/V)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積分數10 %的硫酸乙醇，105 ℃加熱至顯色清楚。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液在相應位置上無干擾(見圖 4)。

1～3 供試品溶液；4 細辛對照藥材溶液；5 細辛脂素對照品溶液；6 陰性供試品溶液。圖3 細辛薄層色譜圖Fig.3 TLC of asari radix et rhizorma

1～3 供試品溶液；4 蓽茇對照藥材溶液；5 胡椒堿對照品溶液；6 陰性供試品溶液。圖4 蓽茇薄層色譜圖Fig.4 TLC of piperis longi fructus

2.2 芥子堿硫氰酸鹽含量測定

2.2.1 色譜條件

參照《中國藥典》2015年版四部通則0512測定[9]， 色譜柱：Phenomenex Geminin C18色譜柱(150 mm×4.6 mm , 5 μm)；以乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87，V/V)為流動相；檢測波長326 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備

取芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為420 μg/mL芥子堿硫氰酸鹽對照品貯備液，精密量取5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇制成濃度為210 μg/mL芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液[10]。

2.2.2.2 供試品溶液的制備

取消喘貼敷膏劑每批4貼，去背襯，剪碎，精密稱定，加甲醇50 mL，超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min，濾過，濾渣再用甲醇同法提取3次，濾液合并。減壓回收溶劑，殘渣用流動相溶解，轉移至50 mL量瓶中，稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得。

2.2.2.3 陰性對照品溶液的制備

取處方中除去白芥子的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺白芥子的陰性對照品，再將該陰性對照品按供試品溶液的制備方法制備，過濾，即得。

2.2.3 專屬性考察

取芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，測定結果見圖5。結果表明，陰性對照品色譜中，與對照品和供試品色譜相應的位置上無干擾色譜峰出現，供試品色譜峰中，芥子堿硫氰酸鹽峰與其他組分分離較好，說明該方法專屬性良好[11]。

圖5 芥子堿硫氰酸鹽高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of sinapine thiocyanate

2.2.4 線性關系考察

圖6 線性回歸標準曲線圖Fig.6 The standard curve of linear regression

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對照品貯備液用甲醇稀釋至含芥子堿硫氰酸鹽42.0、52.5、70.0、105.0、210.0、420.0 μg/mL系列對照品溶液，進樣分析，以進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見圖6。芥子堿硫氰酸鹽線性回歸方程為Y=1 512.3X-79.986，相關系數r=0.999 7。結果表明，芥子堿硫氰酸鹽在0.84～8.4 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗

取芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄相應峰面積，芥子堿硫氰酸鹽峰面積的相對標準偏差為0.31 %，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗

取樣品適量，按“2.2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，在相同的色譜條件下于0、5、10、15、20、24 h進行測定，結果芥子堿硫氰酸鹽峰面積的相對標準偏差為0.79 %。結果表明,供試品溶液在24 h內有良好的穩定性。

2.2.7 重復性試驗

取同批號樣品6份，分別制備成供試品溶液，依法測定芥子堿硫氰酸鹽含量，測得芥子堿硫氰酸鹽含量平均值為2.32 毫克/貼，相對標準偏差為0.87 %，表明重復性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的消喘貼敷膏劑樣品6份，分別精密加入一定量的芥子堿硫氰酸鹽對照品，按“2.2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，平行進樣，記錄峰面積，計算芥子堿硫氰酸鹽的平均回收率為99.61 %，相對標準偏差為0.38 %，結果見表1。

表1 消喘貼敷膏劑中芥子堿硫氰酸鹽的加樣回收試驗(n=6)結果

2.2.9 樣品測定

分別取3批消喘貼敷膏劑，按“2.2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定，3批樣品中芥子堿硫氰酸鹽的含量依次為2.33、2.32、2.32 毫克/貼。

3 討論

在供試品制備方面，所制備的白芥子供試品同時可用于細辛、蓽撥的薄層色譜鑒別，不僅節約成本且能提高日常檢驗工作效率；含量測定對提取方法進行考察，結果表明超聲提取法和加熱回流提取法的提取率沒有明顯的差異，從操作簡便的角度出發選擇超聲提取法。對超聲提取時間(10、30、50、70、90 min)進行考察，根據測定結果，30 min即可提取完全，所以選擇超聲提取時間為30 min。含量測定流動相考察，分別使用乙腈-3%冰醋酸(15∶85,V/V)、乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87,V/V)、乙腈-0.1%磷酸溶液( 35∶65,V/V)作為流動相對本品進行測定，結果表明使用乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87,V/V)為流動相時峰形、分離度均較好。

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015版一部[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2015: 160．

[2]鄧紅, 區潔雯, 張蜀, 等. 復方白芥子巴布劑的質量標準研究[J]. 中成藥, 2010, 32(5): 886-888.

[3]范曉雯, 馬清河, 徐建軍. 驅白白熱斯酊中當歸和白芥子的薄層鑒別[J]. 新疆中醫藥, 2012, 30(5): 58-59.

[4]鄭弘, 許紅瑋. 延胡索不同炮制方法的薄層色譜鑒別對比研究[J]. 中醫學報, 2013, 28 (5): 695-696.

[5]李瑞麗, 王喜民, 張玉東. 薄層色譜法鑒別胃康靈膠囊中白芍、三七和延胡索[J]. 亞太傳統醫藥, 2013, 9(3): 19-20.

[6]翁小洪, 樸春梅, 李平, 等. 消腫止痛膏質量標準研究[J]. 中國藥業, 2014, 23(21): 43-45.

[7]劉淑貞, 趙俊萍. 檳榔十三味丸中蓽茇薄層色譜鑒別的研究[J]. 北方藥學, 2012, 9(1): 8.

[8]留杰, 張國梅. 三味白蔻湯中蓽茇的薄層色譜鑒別[J]. 北方藥學, 2012, 9(4): 7.

[9] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015版四部[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社,2015.[10] 尹珉, 王宏, 曾祖平, 等. HPLC法測定喘寧巴布劑中芥子堿硫氰酸鹽的含量[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(1): 21-22.

[11] 劉麗芳, 王宇新, 劉雪芳, 等. HPLC法測定白芥子藥材中芥子堿硫氰酸鹽的含量[J]. 中國野生植物資源, 2001, 20(5): 49-51.

Study on the quality standard of Xiaochuan Emplastrum

WANG you-feng1, CAO yun-fei2, BAI xiao-ying3*

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355，China; 2.Juxian People′s hospital, Rizhao 276500，China; 3.Qingdao Haici Medical Corp, Qingdao 266033，China)

∶To establish the quality control method of Xiaochuan Emplastrum,Sinapis Semen, Corydalis Rhizoma, Asari Radix et Rhizoma and Piperis Longi Fructus in the Xiaochuan Emplastrum were qualitatively analyzed by TLC. The content of sinapine thiocyanate in sinapis semen was determined by HPLC. The chromatographic column was Phenomenex Geminin C18column(150 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was acetonitrile-0.08 mol/L potassium phosphate monobasic (13∶87,V/V) at the flow rate of 1.0 mL/min, the detection wavelength of 326 nm, the column temperature of 25 ℃ and the sample volume of 20 μL. The results revealed that the spots in the TLC identification of Sinapis Semen, Corydalis Rhizoma, Asari Radix et Rhizoma and Piperis Longi Fructus were clear, well separated and without interference by the negative control. The calibration curve of sinapine thiocyanate showed good linearity in the range of 0.84～8.4 μg (r=0.999 7). The average recovery was 99.58 % (n=6,reltive standard deviatior is 0.37 %). This method is rapid, accurate, reliable, and specific, thus it can be used for the effective quality control of the Xiaochuan Emplastrum.

∶Xiaochuan Emplastrum; TLC; HPLC; sinapine thiocyanate; quality standard

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.008

2016-09-01

青島市 2015—2016 年度中醫藥科研計劃 (2015-zyy012)

王友鳳(1991—)，女，碩士研究生，研究方向為中藥制劑控制區研究、中藥制劑劑型研究，E-mail：714307497@qq.com

*通信作者，白小英。E-mail：baixiaoying72@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)03-0039-06