散養土雞J亞群禽白血病病毒和網狀內皮組織增生癥病毒混合感染的診斷

劉 蘭，梁雄燕,2，李拓凡，顧玉芳，楊玉瑩

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州434025 ； 2.長江大學農學院，湖北荊州434025)

散養土雞J亞群禽白血病病毒和網狀內皮組織增生癥病毒混合感染的診斷

劉 蘭1，梁雄燕1,2，李拓凡1，顧玉芳1，楊玉瑩1

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州434025 ； 2.長江大學農學院，湖北荊州434025)

湖北某農戶散養的土雞，雞群精神委靡、整體消瘦，對病雞進行剖檢，發現部分雞體表和臟器可見大小不等的腫瘤結節。取病變典型的組織制作病理切片，鏡檢可看到髓樣細胞瘤和網狀細胞。提取病雞組織DNA，用兩組Multi-PCR分別檢測A、B、J亞群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和馬立克病病毒(MDV)、禽網狀內皮增生癥病毒(REV)。結果僅擴增出與ALV-J和REV相應的條帶，表明該雞群為ALV-J和REV混合感染。

J亞群白血病 ； 網狀內皮組織增生癥 ； 混合感染 ； 病理組織切片 ； Multi-PCR

禽白血病(AL)、馬立克病(MD)和網狀內皮增生癥(RE)是目前對養禽業危害最大的三大腫瘤性疾病，分別由致瘤性病毒ALV、MDV和REV引起。它們不僅能引發腫瘤，還可引起雞群嚴重的免疫抑制，極易繼發感染其他疾病，導致雞群死亡率增高，造成不可挽回的巨大經濟損失。現在的研究證實，AL、MD和RE在我國禽類養殖中均有存在，且ALV、MDV和REV能混合感染雞群[1-2]，表現出協同致病作用。ALV、MDV和REV混合感染引起的腫瘤眼觀上難以區分，在臨床上極易混淆，使用常規的病理組織學方法難以進行鑒別，病毒的分離和鑒定方法所需時間太長，而應用PCR技術能夠進行快速診斷。ALV-J和REV的混合感染在肉雞和蛋雞中都曾有過報道，但地方雞種ALV-J和REV的混合感染卻少見報道。2015年11月，湖北某養殖戶散養的土雞，雞群精神委靡、整體消瘦，10周齡始陸續死亡。通過觀察臨床癥狀，進而選取癥狀典型的病雞進行病理剖檢，部分雞體表和臟器可見大小不等的腫瘤結節。通過Multi-PCR檢測，確診為ALV-J和REV混合感染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理 湖北某養殖戶送檢的散養土雞，剖檢后取病變典型的組織，一份用甲醛固定，用于制備病理組織切片，另一份存于-80 ℃冰箱，用作PCR檢測。

1.2 主要試劑rTaq、dNTPs等PCR相關試劑以及DL-2 000 DNA Marker等為寶生物工程(大連)有限公司產品。DNA提取相關試劑，由本實驗室配制。

1.3 臨床診斷與病理學觀察 眼觀雞群臨床癥狀，對臨床癥狀典型的雞群進行病理學剖檢，查看各組織臟器的病理變化情況，按照常規方法取材后固定，以備組織切片的制作。

1.4 組織DNA的提取 取癥狀典型的病雞的脾、肺、肝、腎，按文獻提取DNA[3]。

1.5 引物設計 Multi-PCR引物參照相關文獻[4-5]設計，由武漢擎科創新生物有限公司合成，引物序列見表1。

1.6 Multi-PCR檢測 PCR反應體系均采用25 μL體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)2 μL，模板DNA 1 μL， rTaq(5 U/μL)0.25 μL，10 pmol/L的引物(ALV-A/B/JF 2 μL，ALV-AR 1 μL，ALV-BR 1 μL，ALV-JR 1 μL)或(REV-F 1 μL，REV-R 1 μL，MDV-F 1 μL，MDV-R 1 μL)，最后用滅菌ddH2O補足至25 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃(ALV-A/B/J)退火30 s或55 ℃(REV/MDV)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環；72 ℃終末延伸10 min，4 ℃10 min。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀與病理變化 病雞多消瘦、精神委靡、雞冠蒼白、生長遲緩、羽毛松亂、個別雞眼瞼粘連(見中插彩版圖1A);剖檢病雞腺胃腫大，腺胃乳頭出血(見中插彩版圖1B);病雞心臟腫大，切開有白色結節，小腸亦有灰白色腫瘤結節； 肝臟腫大暗紅，表面有白色結節(見中插彩版圖1C)；將病雞跗關節周圍的皮剝離后發現有腫瘤樣贅生物(見中插彩版圖1D)。跗關節切片H.E.染色鏡檢，可見瘤細胞形態基本一致，排列緊密，瘤細胞體積較大，核較大，細胞空泡化、色淡，胞漿內充滿嗜酸性紅染顆粒[見中插彩版圖1E(a為髓細胞)]；脾臟失去原有組織結構，脾臟內能看到網狀細胞和大量形態不一的淋巴細胞增生[見中插彩版圖F(a為網狀細胞，b為大淋巴細胞，c為中淋巴細胞，d為小淋巴細胞)]。

表1 用于檢測ALV-A、ALV-B 、ALV-J和MDV、REV的兩組Multi-PCR引物

2.2 Multi-PCR結果 以病雞組織DNA為模板，用Multi-PCR方法分別檢測ALV-A、ALV-B、ALV-J和MDV、REV，結果從病雞組織DNA中擴增出了與ALV-J大小相近的陽性條帶和與REV大小相近的陽性條帶，而未擴增出與ALV-A/B、MDV相對應的條帶(圖2)，經測序表明二者分別是ALV-J 和REV的核酸序列。結果表明，病雞為ALV-J和REV混合感染。

3 討論

ALV-J和REV是能引起家禽不同組織臟器發生腫瘤和造成宿主免疫抑制的兩種反轉錄病毒，他們對我國的養禽業造成了巨大經濟損失[6]。本試驗對湖北某農戶送檢的土雞進行剖檢，病雞肝臟表面有明顯腫瘤結節，小腸有大小不等的灰白色結節，跗關節有腫瘤增生。而ALV-J、ALV-A、ALV-B以及MDV、REV這幾種病毒均能誘發腫瘤，但是在外觀上不易區分。病雞心肌肥大增厚，腺胃腫大出血，符合網狀內皮增生癥和馬立克病的病理特征，但病雞腔上囊萎縮，卵巢無明顯病理變化，因此僅靠眼觀難以準確判定，確診還須通過PCR等方法。跗關節腫瘤的病理切片中可見到大量髓樣瘤細胞，是ALV-J感染的病理特征，但脾臟組織內能看到網狀細胞和大量形態不一的淋巴細胞增生。為弄清是否存在其他病原，進一步取病變典型的組織，提取組織DNA，用針對ALV-A、ALV-B、ALV-J和MDV、REV的兩組Multi-PCR分別進行檢測，結果僅擴增出與ALV-J和REV前病毒對應的核酸條帶，排除了ALV-A、ALV-B及MDV的感染，最后確診該雞群為ALV-J和REV混合感染。

圖2 Multi-PCR電泳圖

M：DNA Marker DL-2 000； 1：ALV-A/B/J Multi-PCR陽性對照；2：樣本ALV-A/B/J DNA Multi-PCR； 3：ALV-A/B/J陰性對照；4：MDV/REV陽性對照； 5：MDV/REV陰性對照；6：樣本DNA MDV/REV Multi-PCR

本次試驗的結果表明，湖北地區所飼養的一些土雞中存在ALV-J和REV的混合感染，應引起土雞養殖者的重視，在引進雞苗時需要提高警惕，同時還需加強ALV-J和REV的凈化工作。

[1] 張洪海，劉青，邱波，等．地方柴雞中J亞群禽白血病與馬立克氏病的混合感染[J]．畜牧獸醫學報，2009，40(8)：1215-1221．

[2] 宿靖偉，滕蔓，羅俊，等．馬立克病毒與網狀內皮增生病病毒的混合感染及在傳代過程中的重組[J]．畜牧獸醫學報，2016，47(1)：128-134．

[3] 梁雄燕，楊玉瑩，顧玉芳，等．湖北部分肉種雞群J亞群禽白血病血清學調查及PCR檢測[J]．湖北農業科學，2009，48(11)：2636-2638．

[4] Gao Q 1, Yun B, Wang Q,etal. Development and application of a multiplex PCR method for rapid differential detection of subgroup A, B, and J avian leukosis viruses[J]. J Clin Microbiol, 2013, 52(1):37-44.

[5] Sathish G, Parthiban M, Kumanan K,etal. Differential detection of avian oncogenic viruses in poultry layer farms and turkeys by use of multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(8): 2668-2673.

[6] 秦立廷，高玉龍，潘偉，等．我國部分地區蛋雞ALV-J及與REV、MDV、CAV混合感染檢測[J]．中國預防獸醫學報，2010，32(2)：90-93．

2016-05-30

國家自然科學基金項目(31060342)

劉蘭(1992-)，女，碩士，主要研究方向為動物病原分子生物學，E-mail： liulan222@hotmail.com

楊玉瑩，E-mail：yangyycn@gmail.com

S858.31

B

0529-6005(2017)04-0047-02