正交設計試驗優化銀杏葉多酚提取條件的研究

張春生，田 艷，張 萍，王毅紅，譚 萍

（1.六盤水師范學院，貴州六盤水553004；2.六盤水市第十一中學，貴州六盤水553004）

正交設計試驗優化銀杏葉多酚提取條件的研究

張春生1，田 艷2，張 萍1，王毅紅1，譚 萍1

（1.六盤水師范學院，貴州六盤水553004；2.六盤水市第十一中學，貴州六盤水553004）

以沒食子酸為標準品的福林酚法提取銀杏葉多酚，并采用正交設計試驗探究銀杏葉多酚提取的最佳條件。試驗結果表明，銀杏葉多酚提取的最佳條件為福林試劑用量4 mL，福林試劑用量與10%碳酸鈉的配比1∶2，反應時間120 min，反應溫度45℃。

銀杏葉；多酚；福林法；正交設計

銀杏（GinkgobilobaLinn）屬銀杏科（Ginkgoceae）銀杏屬（Ginkgo Linn）植物，別名白果、公孫樹、鴨腳子，屬裸子植物，與它同門的所有其他植物都已滅絕，被稱為“孑遺植物”，在我國廣泛分布，貴州省盤縣石橋鎮妥樂村有古樹分布[1]。銀杏的種子、銀杏根、銀杏葉均可以入藥，并被廣泛用于醫藥界[2-6]。

植物中廣泛存在一類被譽為“第七類營養素”的多酚化合物，酚類化合物是植物次生代謝產物中的重要類型之一，因其具有顯著的抗氧化、抗癌、抗炎及抗突變活性而引起人們的廣泛關注。對多酚提取的研究現在學界較普遍的方法主要有福林酚法、高錳酸鉀法[7]、紫外分光光度法[8]和酒石酸亞鐵比色法[9]等方法，而福林酚法以其穩定性、易操作的特點使用較廣泛。采用福林酚法并以正交設計試驗探究黔產古銀杏葉多酚的提取條件，為開發利用銀杏葉資源提供參考。

1 原料及試驗方法

1.1 原料、藥品及儀器

1.1.1 原料、藥品

古銀杏葉，采自貴州盤縣石橋鎮妥樂古銀杏之鄉，葉片為秋季成熟黃色葉片；沒食子酸標準品；乙醇、鉬酸鈉、濃磷酸、濃鹽酸、鎢酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉、溴水，以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，METTLERTOLEDOAL204型電子天平，萬能粉碎機，硫酸干燥器。

1.2 方法

1.2.1 福林（FC）試劑的配制

按照徐輝艷等人[10]福林試劑的配制，冷藏備用。

1.2.2 制備銀杏葉多酚樣品原液

銀杏葉自然風干后粉碎過40目篩，取25 g銀杏葉粉末樣品置于容量瓶中加入35%乙醇溶液100 mL，于35℃恒溫水浴鍋浸提120 min，浸提液過濾為銀杏葉多酚原液，定容至100 mL。

1.2.3 標準曲線的制作

按照王岸娜等人[11]標準曲線制作方法求得回歸方程，繪制工作曲線。回歸方程為Y=0.131 1X+0.119 1，R2=0.999 6。

標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線

1.2.4 測定銀杏葉多酚樣品原液

取2 mL銀杏葉多酚樣品原液，按照標準曲線的制作操作福林試劑的顯色。

2 結果與分析

2.1 波長選擇

準確吸取沒食子酸標準液與銀杏葉多酚樣品原液，經福林試劑顯色后，分別于波長600～900 nm范圍內掃描，經光吸收曲線比較，二者相同，且確定吸收波長為762 nm。

2.2 福林試劑和10%Na2CO32種溶液配比與吸光度的關系

取2 mL銀杏葉多酚樣品原液，分別加入不同比例的福林試劑和10%Na2CO3溶液，水浴保溫顯色，于波長762 nm處測其吸光度。

試劑配比與吸光度的關系見圖2。

圖2 試劑配比與吸光度的關系

試驗表明吸光度為最大值時，福林試劑和10% Na2CO3用量（mL）的配比為1∶2。

2.3 福林試劑用量與吸光度的關系

取2 mL銀杏葉多酚樣品原液，不同用量的福林試劑加入原液中，水浴保溫顯色，于波長762 nm處測其吸光度。

福林試劑用量與吸光度的關系見圖3。

試驗表明，在其他同等因素下，當福林試劑不斷增加，吸光度先隨著增大一定程度后減小，吸光度為最大值時福林試劑用量為3.5 mL。

2.4 反應時間與吸光度關系

圖3 福林試劑與吸光度的關系

準確吸取2 mL銀杏葉多酚樣品原液于50 mL容量瓶中，吸取3.5 mL福林試劑加入原液中，置于35℃的恒溫水浴鍋中保溫30～150 min，于波長762 nm處測其吸光度。

反應時間與吸光度的關系見圖4。

圖4 反應時間與吸光度的關系

試驗表明，在其他同等因素下，隨著反應時間增加，吸光度也緩慢增加，120 min時吸光度為最大值，120 min之后吸光度開始下降。

2.5 反應溫度與吸光度關系

準確吸取2 mL銀杏葉多酚樣品原液于50 mL容量瓶中，吸取3.5 mL福林試劑加入原液中，置于15～50℃的恒溫水浴鍋中保溫60 min，于波長762 nm處測其吸光度。高溫對多酚結構會產生破壞，不宜驗證過高溫度。

反應溫度與吸光度的關系見圖5。

圖5 反應溫度與吸光度的關系

試驗表明，在其他同等因素下，隨著反應溫度升高吸光度呈上升趨勢，于45℃水浴鍋中保溫時吸光度達到最大值，50℃水浴鍋中保溫時的吸光度降低。

2.6 顯色條件下的正交設計試驗[12]

根據上述福林試劑用量（A）、福林試劑與10% Na2CO3的配比（B）、反應時間（C）、反應溫度（D）各因素試驗結果，現將這4個因素作為試驗因素，吸光度為考查指標，采用L9（34）正交表進行試驗。

試驗因素與水平設計見表1，正交試驗結果見表2。

表1 試驗因素與水平設計

表2 正交試驗結果

由表2可知，各因素影響吸光度大小順序為福林試劑與10%Na2CO3的配比＞福林試劑用量＞反應溫度＞反應時間，即正交試驗表中B＞A＞D＞C，且正交試驗表明各因素的最佳組合為A3B2C3D2。

3 結論

以貴州省盤縣古銀杏之鄉古銀杏葉為原料，對銀杏葉多酚提取條件進行優化，并進一步對正交試驗結果進行分析，得出福林試劑用量4 mL，福林試劑與10%Na2CO3的配比1∶2，反應時間120 min，反應溫度45℃為銀杏葉多酚提取的最佳適宜條件。試驗結果為進一步研究銀杏葉多酚含量的測定及銀杏葉多酚的抗氧化活性提供了基礎，對古銀杏葉的開發利用提供一定參考。

[1]左經會．六盤水藥用植物[M]．北京：科學出版社，2012：1-2.

[2]宋貴櫟．銀杏葉注射液治療冠心病心絞痛的臨床療效及安全性[J]．藥物與臨床，2013，20（7）：66-67.

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[5]馬喬娟．銀杏葉提取物對絕經后冠心病婦女冠脈血流及血管彈性的影響[J]．西部中醫藥，2013，26（2）：24-26.

[6]王樹芳，徐海英，李萌，等.銀杏葉提取物對急性肝衰竭大鼠肝臟組蛋白去乙酰化酶2表達的影響[J]．中國

[7]老年學雜志，2013，33（4）：860-862.王文杰.高錳酸鉀測定法測定茶多酚有關用劑的特性研究[J].福建茶葉，2002（1）：15-17.

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[10]徐輝艷，孫曉東，張佩君，等.紅棗汁中總酚含量的福林法測定[J].食品研究與開發，2009，30（3）：126-128.

[11]王岸娜，徐山寶，劉小彥，等.福林法測定獼猴桃多酚含量的研究[J].食品科學，2008，29（7）：398-401.

[12]譚萍，張萍，王玉珠，等.蕎麥多糖的提取方法及含量測定[J].湖北農業科學，2008，47（8）：955-956.◇

Orthogonal Experimental Design Optimization Study of Ginkgo Biloba Polyphenols Extraction Conditions

ZHANG Chunsheng1，TIAN Yan2，ZHANG Ping1，WANG Yihong1，TAN Ping1
（1.Liupanshui Normal University，Liupanshui，Guizhou 553004，China；2.Liupanshui City No.11 Middle School，Liupanshui，Guizhou 553004，China）

Using forint phenol method as standard substance to extract ginkgo biloba polyphenol，the optimum conditions of extraction of ginkgo biloba polyphenol are investigated by orthogonal design.The results show that the optimum conditions are as follows：forint reagent dosage is 4 mL，forint reagent dosage and 10%sodium carbonate is 1∶2，reaction time is 120 min and reaction temperature is 45℃.

ginkgo biloba；polyphenol；folin method；orthogonal design

R284

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.037

1671-9646（2017）05b-0034-03

2017-04-20

六盤水師范學院科研基金資助項目“黔產古銀杏葉多酚抗氧化活性研究”（LPSSY201213）。

張春生（1982—），男，本科，實驗師，研究方向為植物學實驗及實驗室建設管理。