大黃酚對腦缺血/再灌注小鼠腦組織NO的影響和斷頭抗缺氧作用

王四海，梁春利，張海紅，王樹△

大黃酚對腦缺血/再灌注小鼠腦組織NO的影響和斷頭抗缺氧作用

王四海1，梁春利1，張海紅2，王樹2△

目的研究大黃酚（Chry）對小鼠腦缺血/再灌注損傷后腦組織內NO的影響及其斷頭抗缺氧作用。方法將75只SPF級昆明種小鼠隨機分為假手術組、模型組、大黃酚高劑量組（Chry 10.0 mg/kg）、中劑量組（Chry 1.0 mg/kg）、低劑量組（Chry 0.1 mg/kg）。采用改良Himori法制作小鼠腦缺血/再灌注損傷模型，根據Bederson評分標準測定小鼠神經功能損傷評分。對各組小鼠進行斷頭抗缺氧實驗，記錄小鼠喘息時間，并測定腦組織內NO的含量。結果與模型組比較，大黃酚低、中、高劑量組腦缺血再灌注后神經功能損傷評分和腦組織NO含量明顯降低，斷頭抗缺氧的喘息時間（s）明顯延長［低劑量組，14.6±1.2；中劑量組，16.4±1.2；高劑量組，17.4±1.1；與模型組（13.2±1.0）比較，均P＜0.05］。結論大黃酚可通過減少腦內NO含量和抗缺氧作用對腦缺血/再灌注損傷起到保護效應。

大黃酚；腦缺血；再灌注損傷；一氧化氮；抗缺氧；Himori法

大黃酚（chrysophanol，Chry）是大黃中游離型蒽醌類成分之一，具有廣泛的生物活性，如抗心肌缺血、改善脂肪代謝、抗炎、利尿、抗癌、止咳和神經保護作用等。本課題組前期研究證實，在小鼠腦缺血/再灌注損傷引起的記憶功能障礙中，大黃酚呈現出明顯的神經保護效應［1］。另有研究顯示，腦缺血小鼠由于亞硝酸鈉（NaNO2）中毒可導致耐缺氧能力減弱，而大黃酚能提高小鼠腦組織的耐缺氧能力，明顯延長小鼠存活時間［2］。一氧化氮（NO）在腦缺血/再灌注損傷中的作用機制十分復雜，既可以緩解組織缺血、保護神經細胞受到損傷，又可誘導細胞凋亡發揮神經細胞毒性作用［3-4］。目前有關大黃酚對腦組織中NO的影響及其斷頭抗缺氧作用尚少見報道。本實驗通過改良后的Himori法制作小鼠腦缺血/再灌注損傷實驗模型，研究大黃酚對腦組織中NO的影響及其斷頭抗缺氧作用，為臨床治療腦血管疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 大黃酚購自中國藥品生物制品檢定所（批號 110796-200412，純度≥98%），按照 N，N-二甲基甲酰胺∶聚山梨酯-80∶生理鹽水為1∶1∶8的比例配制溶劑，溶解大黃酚，用生理鹽水稀釋至質量濃度（W/V）為0.1%、0.01%、0.001%備用。NO試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。LabTech全自動紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；FSH-2內切式組織可調高速勻漿器（江蘇大地自動化儀器廠）；二列六孔電熱恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）；Sigma3K30高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Forma-86c ULT冰柜（-80℃，美國熱電公司）。

1.1.2 實驗動物與分組 75只昆明種小鼠，SPF級，雌雄不限，體質量（28±2）g，許可證編號：SYXK（京）2009-0004，購自中國醫學科學院藥物研究所。采用隨機數字表法將小鼠分為5組（n=15）：假手術組正常手術，但不進行腦缺血/再灌注操作；模型組和大黃酚低、中、高劑量組均進行腦缺血/再灌注操作，大黃酚低、中、高劑量組分別于缺血前30 min腹腔注射大黃酚0.1、1.0、10.0 mg/kg；假手術組和模型組分別在缺血前30 min腹腔注射配制溶劑10 mL/kg。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腦缺血/再灌注損傷模型的制備 通過改良Himori法［5］造模。腹腔注射 3.5%水合氯醛（10 mL/kg）麻醉小鼠后，以仰臥位形式固定，在頸部正中縱向切開約6 mm切口，找出兩側頸總動脈并進行分離，用黑色手術線（手術線提前用液體石蠟浸泡）穿過兩側的頸總動脈，盡量將兩側頸總動脈恢復到原位，而后輕柔地將黑色手術線打成松的反手結（在氣管上方），反手結的松緊程度不應壓迫氣管。在兩側頸總動脈的上方黑線上，穿過1條白色手術線（手術線提前用液體石蠟浸泡），根據Himori方法埋好線后將切口縫合。在手術后48 h，拉緊頸下部黑色手術線，使得兩側頸總動脈阻斷，造成大腦缺血，5 min后慢而輕地拉兩側的白色手術線，在頸總動脈中恢復血液再灌注。

根據Bederson評分標準對各組小鼠神經功能損傷情況進行評分：0分，無神經損傷；1分，懸尾試驗不能完全伸展對側前爪；2分，前肢抵抗對側推力下降；3分，向對側轉圈。

1.2.2 斷頭抗缺氧實驗和腦組織內NO含量的測定 假手術組正常手術，但不作腦缺血/再灌注操作；模型組和大黃酚組均在手術后的48 h將血流阻斷5 min，血供恢復后10 min將小鼠快速斷頭處死［6］，觀察小鼠張口喘息情況，以5 s內不再張口喘息作為觀察指標，記錄小鼠喘息時間。

在冰塊生理鹽水上將顱骨快速打開，取出腦，將腦膜及小腦除去，大腦部分保留，用4℃生理鹽水沖洗后，用小濾紙片吸干，放置在1 mL離心管中，然后置于Forma-86C ULT冰柜中進行冷凍貯存。當進行實驗時，把冷凍的腦組織取出并制成體積分數為10%的腦組織勻漿，以3 500～4 000 r/min于低溫離心機（-4℃）進行離心，10 min后取出離心管，將適量上清液取出，以NO試劑盒測定腦組織內NO含量。組織勻漿中NO含量（μmol/L）=［（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標準管吸光度-空白管吸光度）］×標準管濃度（20 μmol/L）。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦缺血/再灌注后小鼠神經功能損傷評分 模型組小鼠腦缺血/再灌注后神經功能損傷嚴重，其神經功能損傷評分（2.90±0.32）明顯高于假手術組（0.10±0.02），大黃酚低、中、高劑量組神經功能損傷評分［分別為（2.40±0.70）、（1.89±0.60）、（1.36±0.50）］均低于模型組，差異有統計學意義（F=82.31，n=15，P＜0.05）。

2.2 大黃酚對小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時間影響 與假手術組比較，模型組小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時間顯著縮短（P＜0.05）；與模型組比較，大黃酚低、中、高劑量組小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時間顯著增加（均 P＜0.05），見表 1。

2.3 大黃酚對小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量的影響 與假手術組比較，模型組小鼠腦組織中NO含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，大黃酚低、中、高劑量組小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量顯著減少（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effects of chrysophanol on NO in brain tissue and gasping time after cerebral ischemia-reperfusion in mice表1 大黃酚對小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時間及腦組織中NO含量的影響 （n=15，±s）

Tab.1 Effects of chrysophanol on NO in brain tissue and gasping time after cerebral ischemia-reperfusion in mice表1 大黃酚對小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時間及腦組織中NO含量的影響 （n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

假手術組模型組大黃酚低劑量組大黃酚中劑量組大黃酚高劑量組F 20.6±1.7 13.2±1.0a14.6±1.2b16.4±1.2b17.4±1.1b43.26＊＊2.5±1.4 5.5±3.0a4.0±1.5b1.5±0.9b2.2±1.5b94.23＊＊

3 討論

本研究結果表明，腦缺血/再灌注模型小鼠腦組織中NO含量顯著增加，這與文獻報道相一致［3-4］，在腦缺血/再灌注損傷中，當神經元產生的NO持續增加，產生過氧化硝基物和過氧化陰離子導致神經毒性，可造成神經細胞的損傷。另外，本研究結果顯示，與模型組比較，大黃酚低、中、高劑量組小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量顯著減少，提示大黃酚對小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量呈現出顯著的抑制效應。氧自由基（oxygen free radical，OFR）生成增多和脂質過氧化的發生是腦缺血/再灌注損傷發病的重要機制，氧自由基的生成對血腦屏障造成很大損傷，加速腦水腫形成、引起血管內皮黏附分子（VECAM）的表達以及血小板和白細胞與內皮的黏附，使得腦缺血/再灌注后腦部的微血管循環障礙加重；同時，隨著腦缺血/再灌注的發展，自由基劇烈增多，導致生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，使細胞膜結構發生損傷，引起細胞膜功能障礙［7］。因此抗自由基損傷是防治腦缺血/再灌注損傷的重要機制之一。NO是自由基損傷的主要標志物之一。由此提示大黃酚可減少腦中NO的含量，清除缺血/再灌注損傷小鼠腦中的自由基，保護大腦功能，是其保護腦缺血/再灌注損傷的重要機制之一。

本研究中斷頭抗缺氧實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠斷頭后抗缺氧的喘息時間顯著縮短；與模型組比較，大黃酚可明顯延長腦缺血/再灌注小鼠抗缺氧的喘息時間，提示小鼠腦缺血/再灌注后急性抗缺氧能力降低，大黃酚能顯著提高小鼠急性抗缺氧的能力。有研究報道，苯腎上腺素（phenylephrine）可誘導豚鼠胸主動脈環血管發生收縮反應，而大黃酚能抑制該收縮效應，呈劑量依賴性；另外，大黃酚還可抑制組胺和氯化鉀誘導的血管收縮效應，分別可降低最大收縮力19.2%和18.8%，表明大黃酚有舒血管的效應，能使血流量增加，從而提高血氧水平［8］。結合本研究，給予小鼠大黃酚后，小鼠的抗缺氧能力明顯增高，提示大黃酚通過舒張小鼠的血管，增加了血流量和血中的氧含量，從而增強了小鼠的抗缺氧能力。由此可推測，大黃酚對腦缺血/再灌注損傷的保護作用與其擴張血管作用有關，詳實機制有待進一步研究。

［1］趙薇，王樹，李方江.大黃酚對小鼠腦缺血/再灌注腦組織抗氧化應激和 AQP4 的影響［J］.中國藥理學通報，2015，31（10）：101477-101478.Zhao W，Wang S，Li FJ.Effects of chrysophanol on antioxidative stress and AQP4 in brain tissue of mice induced by cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2015，31（10）：101477-101478.doi：10.3969/j.issn.1001-1978.2015.10.030.

［2］顏娟，張丹參.大黃酚神經保護作用及其機制研究進展［J］.神經藥理學報，2012，6（2）：52-57.Yan J，Zhang DS.Protective effects and mechanisms of chrysophanol in the nervous system［J］.Acta Neuropharm，2012，6（2）：52-57.

［3］闞亮，張萌，何平.α-硫辛酸對大鼠腦缺血再灌注損傷氧化應激影響［J］.臨床軍醫雜志，2016，44（6）：597-600.Kan L，Zhang M，He P.Effects of α-lipoic acid injection on oxidative stress in rats after cerebral ischemia reperfusion［J］.Clin J Med Offic，2016，44（6）：597-600.doi：10.16680/j.1671-3826.2016.06.13.

［4］曲園，付丹陽，紀影實.丹參磷脂浸膏對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制［J］.吉林大學學報（醫學版），2015，41（2）：291-295.Qu Y，Fu DY，Ji YS.Protective effect of Danshenlinzhi on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its mechanism［J］.Journal of Jilin University（Medicine Edition），2015，41（2）：291-295.doi：10.13841/j.1671-587x.2015.02.16.

［5］趙薇，李方江，王樹.大黃酚對小鼠腦缺血再灌注引起肝損傷的保護作用［J］.神經藥理學報，2014，4（4）：1-9.Zhao W，Li FJ，Wang S.Protective effects of chrysophanol on liver injury induced by cerebral ischemia-reperfusion in mice［J］.Acta Neuropharm，2014，4（4）：1-9.doi：10.3969/j.issn.2095-1396.2014.04.001.

［6］王樹，張力，薛貴平.大黃素對腦缺血再灌注小鼠記憶功能的保護作用［J］.神經藥理學報，2011，1（6）：1-6.Wang S，Zhang L，Xue GP.Protective effects of emodin on the memory of mice experiencing cerebral ischemia reperfusion［J］.Acta Neuropharm，2011，1（6）：1-6.

［7］王四海，郭楨，張秀敏，等.清除自由基對腦缺血損傷的保護作用［J］.河北北方學院學報（自然科學版），2014，30（5）：107-109.Wang SH，Guo Z，Zhang XM，et al.Protective effects of scavenging free radical in cerebral ischemia injury［J］.Journal of Hebei North University（Natural Science Edition），2014，30（5）：107-109.doi：10.3969/j.issn.1673-1492.2014.05.039.

［8］孫曉如，周新新，朱荔，等.中藥羊蹄抑制激動劑誘導血管收縮活性成分的分離及藥理活性的研究［J］.南京醫科大學學報，1999，19（6）：488-490.Sun XR，Zhou XX，Zhu L，et al.Influence of different active components of Rumex japonicas Hott on agonistinduced contraction of thoracic aorta［J］.Acta Universitatis Medicinalis Nanjing，1999，19（6）：488-490.

（2017-01-18收稿 2017-04-12修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effects of chrysophanol on NO of brain tissue and anti-anoxia in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury

WANG Si-hai1,LIANG Chun-li1,ZHANG Hai-hong2,WANG Shu2△
1 Department of Cardiothoracic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Hebei North University,Xuanhua 075100,China;2 Department of Pharmacy,Hebei North University△

E-mail:wangshu388@163.com

ObjectiveTo study the effects of chrysophanol（Chry）on NO of brain tissue and anti-anoxia in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsA total of 75 SPF Kunming mice were randomly allocated into five groups:sham operation group,ischemia-reperfusion group,high-dose group(Chry 10.0 mg·kg-1),medium-dose group(Chry 1.0 mg·kg-1)and low-dose group(Chry 0.1 mg·kg-1).Using improved Himori method,cerebral ischemia reperfusion-injury model was produced in conscious mice by temporarily obstructing bilateral common carotid arteries.The neurological function was measured according to the Bederson scoring standard.The mice were subjected to decapitation for hypoxia tolerance test.The gasping time was measured by anoxia tolerance test in beheaded mice.The level of NO in cerebrum was detected.ResultsChrysophanol can decrease the level of NO in cerebrum of mice with cerebral ischemia-reperfusion injury and prolong the gasping time in beheaded mice with cerebral ischemia-reperfusion injury[low-dose group,(14.6±1.2)s;medium-dose group,(16.4±1.2)s;high-dose group,(17.4±1.1)s;ischemia-reperfusion group,(13.2±1.0)s,P＜0.05].ConclusionThe protective effects of chrysophanol on cerebral ischemia-reperfusion injury are involved in decreasing the content of NO in brain tissue and anti-anoxia in mice.

Chrysophanol;brain ischemia;reperfusion injury;nitric oxide;anti-anoxia;Himori method

R285.5

：A

10.11958/20170078

河北省科技支撐計劃項目（07276166）；河北北方學院自然科學研究項目（2010022）

1河北北方學院第二附屬醫院心胸外科（郵編075100）；2河北北方學院藥學系

王四海（1970），男，碩士研究生，副主任醫師，主要從事多器官損傷保護研究

△通訊作者 E-mail：wangshu388@163.com