高溫漆酶的克隆表達(dá)及其性能的研究

俞青霞+呂斌+葛玨希

摘要：漆酶（laccase），是一種典型的綠色催化劑，應(yīng)用范圍廣泛。目前工業(yè)化的漆酶商品主要來(lái)源真菌發(fā)酵，但在高溫、高鹽或強(qiáng)堿性等極端環(huán)境中，真菌漆酶易失活，限制了其應(yīng)用范圍。相比之下，細(xì)菌漆酶具有耐高溫、耐高堿性的優(yōu)勢(shì)，且發(fā)酵生產(chǎn)周期短，具有廣闊的推廣前景。現(xiàn)歸納近年來(lái)關(guān)于產(chǎn)漆酶菌株的分離、漆酶的克隆表達(dá)等研究成果，對(duì)高溫漆酶的克隆表達(dá)和性能研究對(duì)于拓展漆酶的范圍、深入地進(jìn)行高溫漆酶的理論研究，指出高溫漆酶良好的開(kāi)發(fā)前景，以此來(lái)擴(kuò)大漆酶的應(yīng)用范圍。

關(guān)鍵詞：高溫漆酶；克隆表達(dá)；性能

漆酶（Laccase， p-diphenoldioxygen：oxidoreductase， EC 1.10.3. 2），即p-對(duì)苯二酚：雙氧氧化還原酶，是一種多酚類(lèi)氧化還原蛋白，屬于藍(lán)多銅氧化酶家族（bluemulticopperoxid- oreductase， BMCOs）[1]。漆酶具有特殊的催化性能和非常寬泛的底物專一性，能夠利用多種酚類(lèi)化合物及其衍生物、芳香胺及其衍生物等為氫供體，以O(shè)2為電子受體，催化底物氧化使之生成相應(yīng)的苯配和水，是一種環(huán)境友好的綠色催化劑[2]。

漆酶的底物非常廣泛，主要是酚類(lèi)化合物、芳胺類(lèi)、芳香梭酸類(lèi)、甾體激素及生物色素、金屬有機(jī)化合物等[3， 4]。因此，漆酶可以用來(lái)處理木質(zhì)素、酚類(lèi)污染物、農(nóng)藥、除草劑等，在環(huán)境保護(hù)、造紙工業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域具有很大的研究和應(yīng)用價(jià)值，另外，利用漆酶進(jìn)行藥物的修飾加工、功能高分子材料的合成也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一[5]，熱穩(wěn)定性較好的漆酶因在污水處理、功能高分子的合成等領(lǐng)域具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值而倍受關(guān)注[6， 7]。

1.獲取耐高溫漆酶的基因片段

提取嗜熱芽孢桿菌DNA；設(shè)計(jì)引物，獲得僅表達(dá)高溫漆酶的基因片段，并用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增；將基因片段連接到載體上，并轉(zhuǎn)入表達(dá)型大腸桿菌細(xì)胞（BL21）；測(cè)序，驗(yàn)證所獲片段是否為耐高溫片段；分離純化BL21表達(dá)的蛋白，該蛋白即為高溫漆酶。

2.高溫漆酶的耐受溫度范圍及最適反應(yīng)溫度

高溫漆酶最適反應(yīng)溫度為60℃，該高溫漆酶在20℃-90℃均具備活性。但因?yàn)闇囟忍荻纫?0℃為間隔，根據(jù)曲線趨勢(shì)觀察，最適反應(yīng)溫度也有可能介于50℃-60℃之間。

3.高溫漆酶的耐受pH范圍

經(jīng)測(cè)量可知，高溫漆酶在4-11pH值的條件下酶活大小有較大變化，在4.0、5.0、9.0、10.0和11.0的條件下，高溫漆酶的酶活幾乎接近于0%，而在pH值為7.0時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到最大。可知高溫漆酶的pH耐受范圍為5.0-9.0，最適pH反應(yīng)條件為7.0。

4.抑制劑、有機(jī)溶劑對(duì)高溫漆酶的活性影響

4.1抑制劑對(duì)高溫漆酶的活性影響

抑制劑對(duì)酶活的影響如表1所示。三種抑制劑中DDT對(duì)高溫漆酶的一直效果最顯著，DDT濃度為0.1mmol/L時(shí)就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA對(duì)高溫漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明顯，在濃度為100mmol/L時(shí)，殘余酶活性仍舊能夠達(dá)到50%以上；SDS對(duì)高溫漆酶不僅沒(méi)有較強(qiáng)的抑制作用，反而對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)SDS濃度為10mmol/L時(shí)，酶活性仍有升高現(xiàn)象。

4.2有機(jī)溶劑對(duì)高溫漆酶的活性影響

根據(jù)測(cè)量可知，高溫漆酶的活性隨著有機(jī)溶劑濃度的升高而降低。三種有機(jī)溶劑中，丙酮和乙醇對(duì)高溫漆酶活性的影響比甲醇要大，當(dāng)乙醇和丙酮的濃度達(dá)到20%時(shí)，高溫漆酶的殘余酶活就下降到了50%以下。

5.結(jié)論

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，高溫漆酶最適反應(yīng)溫度為60℃，該高溫漆酶在20℃-90℃均具備活性；高溫漆酶的pH耐受范圍為5.0-9.0，最適pH反應(yīng)條件為7.0；DDT對(duì)高溫漆酶的一直效果最顯著，DDT濃度為0.1mmol/L時(shí)就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA對(duì)高溫漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明顯，在濃度為100mmol/L時(shí)，殘余酶活性仍舊能夠達(dá)到50%以上；SDS對(duì)高溫漆酶不僅沒(méi)有較強(qiáng)的抑制作用，反而對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)SDS濃度為10mmol/L時(shí)，酶活性仍有升高現(xiàn)象。

高溫漆酶的活性隨著有機(jī)溶劑濃度的升高而降低。三種有機(jī)溶劑中，丙酮和乙醇對(duì)高溫漆酶活性的影響比甲醇要大，當(dāng)乙醇和丙酮的濃度達(dá)到20%時(shí)，高溫漆酶的殘余酶活就下降到了50%以下。此高溫漆酶對(duì)結(jié)晶紫和靚紅有很強(qiáng)的脫色效果，此高漆酶酶的酶學(xué)性質(zhì)表明此酶具有一定的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Galhaup C， Goller S， Peterbauer CK， Strauss J， Haltrich D. Characterization of the major laccaseisoenzyme from Trametespubescens and regulation of its synthesis by metal ionsa[J]. Microbiology. 2002，148（7）： 2159-2169.

[2]陶亮亮. 重組里氏木霉產(chǎn)耐髙溫漆酶的研究 [D]. 杭州： 浙江大學(xué). 2014.

[3]Baldrian P. Fungal laccases–occurrence and properties [J]. FEMS microbiology reviews. 2006，30（2）：215-242.

[4]宋安東， 王艷婕， 王松江， 戚元成， 吳坤. 漆酶的分子生物學(xué)研究及其應(yīng)用[J]. 信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版. 2004，17（2）：244-248.

[5]Riva S. Laccases： blue enzymes for green chemistry[J]. TRENDS in Biotechnology. 2006，24（5）：219-226.

[6]Chairattanamanokorn P， Imai T， Kondo R， Ukita M， Prasertsan P. Screening thermotolerant white-rot fungi for decolorization of wastewaters[J]. Applied biochemistry and biotechnology. 2006，128（3）：195-204.

[7]Kiiskinen LL， R?tt? M， Kruus K. Screening for novel laccase‐producing microbes[J]. Journal of applied microbiology. 2004，97（3）：640-646.