青蒿素對ApoE-/-基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

曹 乾，杜洪姣，史 瑾，李曉東

·論著·

青蒿素對ApoE-/-基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

曹 乾*，杜洪姣，史 瑾，李曉東

目的 探討青蒿素對ApoE-/-基因敲除小鼠動脈粥樣硬化以及炎癥因子的影響。方法 將20只ApoE-/-基因敲除小鼠分為青蒿素組和PBS處理組，每組10只，經高脂喂養8周，與對照組小鼠(C57BL/6J標準飲食小鼠，10只)比較，通過血管大體油紅O染色評價斑塊面積；HE染色觀察病變形態及血漿中炎癥因子的變化。結果 與對照組比較，PBS處理組及青蒿素組均可見動脈硬化斑塊，炎癥因子水平升高。青蒿素組的動脈硬化程度及炎癥因子水平均明顯低于PBS處理組。結論 青蒿素可以改善ApoE-/-基因敲除小鼠動脈粥樣硬化進展。

青蒿素；ApoE-/-基因敲除小鼠；動脈粥樣硬化

0 引言

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種全身性慢性動脈疾病，可以侵害大、中動脈，造成血管內膜增厚、僵硬、管腔面積狹窄。血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和遷移與動脈粥樣硬化發生發展關系密切，同時動脈粥樣硬化整個過程都有炎性反應參與[1]。有研究表明，炎性細胞因子及抗炎細胞因子的表達失衡參與調節動脈粥樣硬化。青蒿素(Artemisinin，ART)又名黃花蒿素，是由菊科植物黃花蒿所提煉出來的倍半萜內酯化合物，除具有抗瘧疾作用，近年研究發現，其還具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗炎[4-5]等廣譜的生物學和藥理學活性。

由于ApoE-/-基因敲除小鼠動脈硬化模型與人體相似度高，近年來已經成為研究動脈硬化的重要模型[6]。本研究通過建立小鼠動脈粥樣硬化模型，觀察青蒿素對動脈粥樣硬化以及炎癥因子的影響，為臨床治療AS提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J小鼠10只，健康雄性ApoE-/-基因敲除小鼠20只，體重16～20 g，由華阜康公司提供，青蒿素，ELISA試劑盒，多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯、水合氯醛、蘇木精、伊紅、戊二醛等均由我院中心實驗室提供，青蒿素：Dalian Meilun Biotech Co.，Dalian。

1.2 動物分組與模型建立

1.2.1 小鼠動脈粥樣硬化模型的建立及分組 對照組：C57BL/6J小鼠10只，每日給予標準飼料20 g，喂養8周；相同標準劑量生理鹽水腹腔注射，注射8周。PBS處理組：健康雄性ApoE-/-基因敲除小鼠10只，每日給予高脂飼料20 g，喂養8周；相同標準劑量生理鹽水腹腔注射，注射8周。青蒿素組：健康雄性ApoE-/-基因敲除小鼠10只，每日給予高脂飼料20 g，同時腹腔注射青蒿素(參考劑量：100 mg/kg)，喂養8周。

8周后，留取血清標本，處死小鼠后各組留取主動脈，部分經液氮速凍后置于-70 ℃保存，部分置于甲醛中固定48 h，備后續實驗。

1.2.2 組織染色 油紅O染色確定斑塊面積及部位。油紅O染色：①用干凈清潔的硅化載玻片粘取冷凍切片，切片干燥后入60%異丙醇浸洗10 min。②油紅O工作液染色10 min，避光。③ddH2O漂洗15 s，60%異丙醇分化3～10 s至間質清晰，水洗。④Mayer蘇木精復染1 min，自來水返藍。⑤濾紙小心吸干水分，甘油明膠封片。

HE染色觀察病變分級。HE染色：將主動脈置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h以上，常規石蠟包埋，切至7 μm薄片，置于蘇木精中染色1 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，伊紅染液染色2 min，切片入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1 min，入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各3 min后，滴加適量中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3 觀察指標與檢測方法 以體視顯微鏡及光學顯微鏡觀察三組標本。用斑塊百分比(動脈粥樣硬化斑塊面積/動脈總面積)反映動脈硬化程度。圖片經Photoshop、Image-Pro-Plus 6.0等軟件對紅色斑塊面積進行圈定計算，以及對小鼠主動脈總面積的圈定計算，結果以斑塊百分比=動脈粥樣硬化斑塊面積/動脈總面積表示。分別計算各組小鼠的平均百分比，對數據進行統計分析。

2 結果

飼養后8周的小鼠血脂情況見表1。

表1 小鼠血脂指標(mmol/L)

體視顯微鏡觀察顯示，PBS處理組主動脈大部分灰白不透明，弓斑塊明顯，大小不等，管壁彈性差。青蒿素組主動脈大部分呈透明狀，主動脈可見灰白色斑塊，呈斑點狀，但面積明顯小于PBS處理組，且管壁彈性較好。對照組主動脈管壁透明，無AS病灶。見圖1。光學顯微鏡觀察：PBS處理組主動脈管壁可見由泡沫細胞形成的脂紋脂斑和膽固醇結晶，管壁厚薄不均。青蒿素組主動脈管壁可見輕度增厚隆起，厚薄較均勻，少量炎癥細胞。見圖2。

圖1 油紅染色

圖2 HE染色

對照組動脈管腔面積(363.95±32.17)×10-3mm2；PBS處理組動脈管腔面積(334.53±45.40)×10-3mm2，斑塊面積43.58 mm2，比例13.03%；青蒿素組動脈管腔面積(350.36±39.73)×10-3mm2，斑塊面積28.22 mm2，比例8.05%。青蒿素處理后的 ApoE-/-小鼠心臟三尖瓣部位的動脈粥樣硬化斑塊面積平均值較PBS處理組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。PBS處理組和青蒿素組間的主動脈部位動脈粥樣硬化斑塊面積百分比平均值比較差異有統計學意義(13.03% vs.8.05%，P<0.05)。見圖3。

圖3 小鼠主動脈管腔面積

PBS處理組炎癥因子的TNF-α、hs-CRP表達較對照組明顯升高(P<0.05)，SOD明顯下降(P<0.05)；青蒿素組炎癥表達有所改變，與PBS處理組比較差異有統計學意義。見表2。

表2 三組小鼠炎癥因子表達情況

3 討論

動脈硬化是一種嚴重威脅人類健康的疾病，發病率和致殘率均高，其防治日益受到重視[7-8]。動脈硬化可能與內皮損傷、氧化應激、炎癥反應、平滑肌增殖等多方面因素有關[9]。ApoE-/-基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型由于造模較容易，并且與人類動脈硬化相似度高，而被廣泛應用于科學研究[10]。

青蒿素化學結構中存在內過氧橋，斷裂后產生的碳中心自由基分子和ROS是其發揮藥理學和毒理學作用的共同結構基礎。近年來，關于青蒿素的研究已經從抗瘧疾治療領域擴展到針對炎癥、氧化及平滑肌增殖等諸多領域[11-12]。筆者前期試驗中進行了不同劑量的篩選以及細胞毒理學研究。本研究選取100 mg/kg的青蒿素[13-14]，針對青蒿素對ApoE-/-基因敲除小鼠早期動脈硬化程度的影響以及動脈硬化中的炎癥因子進行了檢測。從炎癥角度評價青蒿素延緩動脈硬化進程的作用。體視顯微鏡及光鏡下均顯示，對于易患個體(ApoE-/-基因敲除小鼠)，高脂飲食明顯促進主動脈動脈硬化程度進展。給予干預因素(青蒿素治療)后，動脈硬化程度得到延緩。青蒿素干預組的斑塊百分比明顯降低，主動脈管腔面積增加，同時炎癥因子CRP、腫瘤壞死因子水平明顯降低。提示青蒿素具有通過抑制炎癥反應、改善氧化應激等途徑延緩動脈硬化進程的作用。研究表明，其通過NF-κB和 MAPK調節炎癥反應[15-16]。具體劑量方法、作用環節有待進一步研究證實[17-18]。

[1] Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2):115-126.

[2] Wang Z,Hu W,Zhang JL,et al.Dihydroartemisinin induces autophagy and inhibits the growth of iron-loaded human myeloid leukemia K562 cells via ROS toxicity[J].FEBS Open Bio,2012,2:103-112.

[3] Lai HC,Singh NP,Sasaki T.Development of artemisinin compounds for cancer treatment[J].Invest New Drugs,2013,31(1):230-246.

[4] Tu Y.The discovery of artemisinin (qinghaosu) and gifts from Chinese medicine[J].Nat Med,2011,17(10):1217-1220.

[5] Park KH,Yoon YD,Han SB,et al.Artemisinin inhibits lipopolysaccharide-induced interferon-β production in RAW 264.7 cells:implications on signal transducer and activator of transcription-1 signaling and nitric oxide production[J].Int Immunopharmacol,2012,14(4):580-584.

[6] Li Y,G ZC,Wang XH,et al.Progression of atherosclerosis in ApoE-knockout mice fed on a high-fat diet[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(18):3863-3867.

[7] Yan J,Zang X,Chen R,et al.The clinical implications of increased cyclophilin A levels in patients with acute coronary syndromes[J].Clin Chim Acta,2012,413(7-8):691-695.

[8] 郭曉玲,李琳,李巖,等.不同劑量纖溶酶聯合他汀類藥物治療頸動脈硬化斑塊臨床效果分析[J].中國醫藥,2016,11(12):1781-1784.

[9] Wei Y,Jinchuan Y,Yi L,et al.Antiapoptotic and proapoptotic signaling of cyclophilin A in endothelial cells[J].Inflammations,2013,36:567-572.

[10]陳玲,于楊,陳曼華.哌唑嗪對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響[J].實用醫學雜志,2016,32(13):2123-2126.

[11]Tan SS,Ong B,Cheng C,et al.The antimalarial drug artesunate inhibits primary human cultured airway smooth muscle cell proliferation[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,50(2):451-458.

[12]Ghaffarifar F,Esavand HF,Dalimi A,et al.Evaluation of apoptotic and antileishmanial activities of artemisinin on promastigotes and Balb/C mice infected with leishmania major[J].Iran J Parasitol,2015,10(2):258-267.

[13]Wang HY,Huang RP,Han P,et al.The effects of artemisinin on the proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells of rats[J].Cell Biochem Funct,2014,32(2):201-208.

[14]Cao Q,Jiang Y,Shi J,et al.Artemisinin inhibits tumour necrosis factor-α-induced vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and attenuates balloon injury-induced neointima formation in rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2015,42(5):502-509.

[15]Yoon JJ,Lee YJ,Han BH,et al.Protective effect of betulinic acid on early atherosclerosis in diabetic apolipoprotein-E gene knockout mice[J].Eur J Pharmacol,2017,796:224-232.

[16]Wang KS,Li J,Wang Z,et al.Artemisinin inhibits inflammatory response via regulating NF-κB and MAPK signaling pathways[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2017,39(1):28-36.

[17]Lee KP,Park ES,Kim DE,et al.Artemisinin attenuates platelet-derived growth factor BB-induced migration of vascular smooth muscle cells[J].Nutr Res Pract,2014,8(5):521-525.

[18]Kocks M,Jessup W.Atherosclerosis cellular pathway in atherogenesis[J].Pharmacol Ther,2010,128:106-118.

Effect of artemisinin on atherosclerosis of ApoE-knockout mice

CAO Qian*,DU Hong-jiao,SHI Jin,LI Xiao-dong

(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the influence of artemisinin on atherosclerosis and the inflammatory factors of ApoE-knockout mice.Methods Twenty rigorously selected ApoE-knockout mice were randomly divided into artemisinin-treated group (ATG) and PBS-treated group (PTG),and 10 C57 mice were chosen as control group (CHFG).After 8 weeks of high-fat diet,HE staining and oil-red staining were administrated to evaluate the degree of artery atherosclerosis,and detect the plasma levels of inflammatory cytokine.Results Compared with CHFG,the degrees of artery atherosclerosis of ATG group and PTG group exacerbated and the plasma levels of inflammatory cytokine were dramatically elevated (P<0.05).The degree of artery atherosclerosis and plasma levels of inflammatory cytokine in ATG groups were lower than those of PTG group (P<0.05).Conclusion Artemisinin can inhibit the atherosclerotic progress of high-fat fed ApoE-knockout mice.

Artemisinin;ApoE knock-out mice;Atherosclerosis

2017-01-23

中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110004

遼寧省省直醫院改革重點臨床科室診療能力建設項目(LNCCC-D10-2015)；中國醫科大學附屬盛京醫院優秀博士課題資助項目(201608)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706001

*通信作者