姜黃素與卡鉑聯合用藥對鼠卵巢癌轉基因細胞系的影響

高英卓，孔令婷，齊亞飛，王勁歐，曹程程，呂慶杰

姜黃素與卡鉑聯合用藥對鼠卵巢癌轉基因細胞系的影響

高英卓，孔令婷，齊亞飛，王勁歐，曹程程，呂慶杰*

目的 探討姜黃素與卡鉑聯合用藥對鼠卵巢癌轉基因細胞系T1、T2、T3的影響。方法 采用MTT法檢測卡鉑、姜黃素單獨及聯合用藥對鼠卵巢癌轉基因細胞系增殖的影響，RT-PCR及Western blot檢測各組細胞中K-RAS、PI3K、AKT的表達水平。結果 通過MTT法檢測細胞增殖抑制率，各濃度卡鉑單獨作用于鼠卵巢癌轉基因細胞系T1、T2、T3的增殖抑制率<30%，與姜黃素聯用后，增殖抑制率均>30% (P<0.05)，對轉染了AKT的T2、T3作用更明顯。聯合組T1、T2、T3細胞的K-RAS、PI3K (p-PI3K)、AKT (p-AKT)的mRNA及蛋白表達量低于卡鉑單用組。結論 鼠卵巢癌轉基因細胞系T1、T2、T3對卡鉑具有耐藥性。姜黃素可逆轉其對卡鉑的耐藥性，且對含有AKT的T2、T3作用更加明顯。姜黃素的逆轉作用可能與抑制K-RAS、PI3K、AKT的表達有關，其也可能直接抑制PI3K/AKT信號通路。

姜黃素；卡鉑；卵巢癌

0 引言

卵巢癌的死亡率在女性生殖系統惡性腫瘤中居首位[1]。姜黃素(Curcumin，Cur)是從中藥姜黃中提取的一種相對分子質量小的脂溶性多酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、清除自由基、抗微生物等多方面藥理作用[2]，美國國立腫瘤所已將其列為第3代癌化學預防藥物[3]。卡鉑(Carboplatin，Cap)是一種抗癌譜廣、抗癌作用強、與多種抗癌藥具有協同作用的第2代鉑絡合物[4-7]，現已廣泛應用于臨床。

本實驗通過觀察姜黃素與卡鉑單獨或聯合用藥對鼠卵巢癌轉基因細胞系的影響，探討姜黃素對鼠卵巢癌細胞系的抑制作用機制與K-RAS及其下游的PI3K/AKT信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 姜黃素(美國Sigma公司)，卡鉑注射液(波貝，齊魯制藥有限公司)，二苯基四氮硅溴(MTT，華美生物工程公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，K-RAS、p-PI3K、p-AKT抗體(博奧森公司)，β-actin(Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標抗羊/兔IgG抗體(二抗，北京中山生物技術有限公司)，細胞培養板與培養瓶(Corning)。

1.1.2 儀器 CO2孵箱(Heraues)，低溫高速離心機(Sigma)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)。

1.1.3 細胞株 本研究應用具有明確基因型的卵巢癌細胞系T1、T2、T3，該體系以逆轉錄病毒為載體，將一系列確定可引起遺傳突變的癌基因(c-myc、K-RAS、AKT基因)轉染到p53基因敲除的雌性成年大鼠的卵巢表面上皮細胞內。大鼠卵巢癌細胞系的生成如下：C1(基因型：p53-/-，c-myc，K-RAS)，C2(基因型：p53-/-，c-myc，AKT)，C3(基因型：p53-/-，K-RAS，AKT)。由C1、C2、C3來源的腫瘤結節分離后，進行體外培養，形成鼠卵巢癌轉基因細胞系T1、T2、T3。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 鼠卵巢癌轉基因細胞系T1、T2、T3用含10%胎牛血清DMEM高糖培養基，在37 ℃、5% CO2、相對濕度90%的培養箱中培養，常規方法消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。分組：對照組為空白組；實驗組為卡鉑單用組，濃度為1、2、4、8 μg/mL；卡鉑姜黃素聯用組，即各濃度卡鉑與20 μmol/L姜黃素聯用。

1.2.2 MTT比色分析法檢測細胞增殖抑制率 分別檢測卡鉑單用及卡鉑與姜黃素聯合作用于T1、T2、T3的細胞增殖抑制率，方法參照MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書，以上實驗重復3次。平均生長抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，其值<30%為耐藥。

1.2.3 實時定量PCR法檢測細胞K-RAS、PI3K、AKT的mRNA表達量 Trizol法抽提總RNA，樣品-80 ℃保存，利用紫外分光光度計檢測RNA樣品濃度和純度，逆轉錄合成cDNA，PCR擴增，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測K-RAS、p-PI3K、p-AKT蛋白表達 取對數生長期的T1、T2、T3細胞，卡鉑單用或卡鉑姜黃素聯合作用24 h后，回收細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，于10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，參照Western blot常規方法，ECL試劑盒顯影并成像。每組重復3次。以Bioimagining System灰度測量系統測量Wb條帶灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件對所有數據進行統計分析，計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測T1、T2、T3細胞增殖抑制率 各濃度卡鉑(1、2、4、8 μg/mL)單獨作用于T1、T2、T3細胞的增殖抑制率均<30%，表明鼠卵巢癌轉基因細胞系T1、T2、T3對卡鉑具有耐藥性；單用姜黃素20 μmol/L作用于3種細胞的增殖抑制率<30%。當各濃度卡鉑與姜黃素20 μmol/L聯用時，細胞增殖抑制率升高。結果表明，姜黃素逆轉了T1、T2、T3對卡鉑的耐藥性。當藥物濃度為CBP 1+Cur 20時，T1細胞(33.11%)與T3細胞(70.92%)比較差異有統計學意義(P<0.05)；CBP 4+Cur 20時，T1細胞(43.71%)與T2細胞(88.01%)比較差異有統計學意義(P<0.05)；CBP 8+Cur 20時，T1細胞(50.26%)與T3細胞(90.5%)比較差異有統計學意義(P<0.05)。卡鉑與姜黃素聯用時，T2和T3的細胞增殖抑制率高于T1細胞。見圖1。

圖1 MTT法檢測T1、T2、T3細胞增殖抑制率

注：CG：空白對照組；C1：卡鉑濃度1 μg/mL，以此類推；Cur：姜黃素濃度均為20 μmol/L。同種細胞卡鉑姜黃素聯用組與同濃度卡鉑單用組比較，*P<0.05，**P<0.01；卡鉑姜黃素聯用時，同樣藥物濃度，不同細胞間比較，△P<0.05

2.2 RT-PCR檢測K-RAS、PI3K、AKT的mRNA表達水平 相應試劑作用24 h后，各組T1、T2、T3細胞K-RAS、PI3K及AKT的mRNA表達量見表2。△△CT=(CT目的基因-CT管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)對照組，用2-△△CT表示mRNA的表達量，對照組為1。T1的AKT基因、T2的K-RAS基因呈低表達。

2.3 關聯分析 聯用組T3細胞的K-RAS與PI3K mRNA表達量呈正相關(r=0.97，P<0.05)，提示姜黃素可能通過K-RAS影響PI3K的表達，來逆轉卵巢癌轉基因細胞對卡鉑的耐藥性。

2.4 Western blot檢測K-RAS、p-PI3K及p-AKT的蛋白表達水平 記錄K-RAS、p-PI3K及p-AKT的蛋白表達水平，進行灰度翻轉，計算其灰度值，見圖2。

K-RAS。T1：C4+Cur組較C4組降低(P<0.05)，C8+Cur組較C8降低(P<0.01)；T3：C1+Cur組較C1降低(P<0.05)。T2呈低表達。卡鉑姜黃素聯用組T1、T3細胞K-RAS的蛋白表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

p-PI3K。T1：C2+Cur較C2降低(P<0.01)；T2：C2+Cur較C2降低(P<0.05)，C4+Cur較C4降低(P<0.01)；T3：C1+Cur較C1降低(P<0.05)，C4+Cur較C4降低(P<0.05)，C8+Cur較C8降低(P<0.01)。C4+Cur組T3的p-PI3K表達量高于T1(P<0.05)。

p-AKT。T2：C2+Cur較C2降低(P<0.01)，C4+Cur較C4降低(P<0.01)；T3：C4+Cur較C4降低(P<0.05)，C8+Cur較C8降低(P<0.05)。C2+Cur組T3的表達高于T1。

3 討論

本研究應用具有明確基因型的鼠卵巢癌轉基因細胞系T1(p53-/-，c-myc，K-RAS)、T2(p53-/-，c-myc，AKT)、T3(p53-/-，K-RAS，AKT)，觀察到各濃度卡鉑或姜黃素(20 μmol/L)單獨作用于T1、T2、T3的細胞增殖抑制率均低于30%，聯合應用卡鉑與姜黃素組均高于30%，說明鼠卵巢癌轉基因細胞系對卡鉑具有耐藥性，姜黃素逆轉了其對卡鉑的耐藥性。卡鉑姜黃素聯用組T2、T3的細胞增殖抑制率均高于T1細胞，而T2、T3的細胞增殖抑制率無顯著差異。T1與T2均具有c-myc基因，二者的差異可能是由于K-RAS和AKT基因的不同；然而，T1與T3均具有K-RAS基因，由此推斷，T2和T3的細胞增殖抑制率高于T1細胞，可能是由于T1細胞缺乏AKT基因，AKT基因是姜黃素逆轉卵巢癌細胞耐藥性的重要靶點。

卡鉑姜黃素聯用組T1、T3細胞的K-RAS表達量低于卡鉑單用組，聯用組T1、T2、T3細胞的PI3K表達量低于卡鉑單用組，提示姜黃素逆轉卵巢癌細胞對卡鉑的耐藥性可能與K-RAS、PI3K有關。PI3K是AKT的上游調節因子[8]，提示姜黃素逆轉作用與PI3K/AKT信號通路有關。

姜黃素是姜科植物的根莖，在亞洲應用歷史悠久。目前認為，姜黃素能影響腫瘤發生發展的多個環節與步驟[9-11]。前期研究結果表明，姜黃素對細胞增殖的抑制率隨濃度增高而增加，表現為明顯的濃度-效應依賴關系。當姜黃素濃度為20 μmol/L時，作用時間為24 h，其對T1、T2、T3的增殖抑制率為15%～35%，表明單獨應用姜黃素對卵巢癌細胞抑制作用較小。有研究表明，姜黃素誘導卵巢癌細胞凋亡具有p53依賴性[12-13]，同時涉及p38絲裂原活化蛋白激酶激活及下調Bcl-2、Bcl-X、Survivin表達和AKT信號。目前，姜黃素在應用中存在的主要問題是生物利用度低，研究合成其衍生物以改善其化學性質近年來已有報道[14-16]。隨著對姜黃素抗癌作用機制和構效關系的深入研究，姜黃素將有望作為新型植物來源抗腫瘤藥物應用于人類癌癥的治療和預防。活化的RAS基因能直接和PI3K調節亞基p110結合。

表2 T1、T2、T3細胞K-RAS、PI3K及AKT的mRNA水平

注：CG：空白對照組；C1：卡鉑濃度1 μg/mL，以此類推；Cur：姜黃素濃度均為20 μmol/L。同種細胞卡鉑姜黃素聯用組與同濃度卡鉑單用組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 T1、T2、T3細胞K-RAS、p-PI3K、p-AKT的蛋白水平

PI3K/AKT信號通路參與抗細胞凋亡，促進細胞增殖、遷移、癌性轉化等過程。研究表明，通過降調PI3K/AKT表達可提高卵巢癌對鉑類藥物的敏感性[17]。研究顯示，以PI3Kp110α、AKT為靶點的RNA干擾技術有望成為卵巢癌基因治療的新策略。PI3K通路并非AKT激活的唯一途徑[18]。過表達的Lewis(y)抗原通過激活PI3K/AKT信號轉導通路促進卵巢癌RMG-I細胞的增殖，抑制Lewis(y)抗原表達可能是一種治療Lewis(y)高表達腫瘤的新方法。

MAPK通路中的RAS基因屬于GTP酶基因家族，約30%的腫瘤發生中存在RAS基因突變，其中約85%為K-RAS突變，活化的RAS能直接結合并激活PI3K的催化亞基。PI3K/AKT通路與RAS/MAPK通路在功能上十分類似[19]，兩者之間存在一定程度的補償作用，即一條通路的抑制可能導致另一條通路的異常活化。這種作用可以使細胞外的致瘤信號增強，但有時也會使信號減弱。因此，應用具有同時抑制雙通路的藥物會起到較好的治療作用。

綜上所述，卵巢癌轉基因細胞系T1、T2、T3對卡鉑具有耐藥性，姜黃素可逆轉其對卡鉑的耐藥性，且對含有AKT的T2、T3作用效果更加明顯，提示姜黃素逆轉卵巢癌對卡鉑的耐藥性可能與AKT密切相關。通過檢測3種細胞的K-RAS、PI3K及AKT表達水平發現，其逆轉機制可能與抑制K-RAS、PI3K、AKT的表達有關，也可能直接抑制PI3K/AKT信號通路。

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Effect of curcumin combined with carboplatin on ovarian cancer transgenic cell lines

GAO Ying-zhuo,KONG Ling-ting,QI Ya-fei,WANG Jin-ou,CAO Cheng-cheng,Lü Qing-jie*

(Department of Pathology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To investigate the effect of curcumin combined with carboplatin on rat′s ovarian cancer transgenic cell line T1,T2 and T3.Methods The effect of carboplatin and curcumin alone and in combination on proliferation of rat′s ovarian cancer transgenic cell lines was detected by MTT method,and the expression levels of K-RAS,PI3K and AKT were detected by RT-PCR and Western blotting.Results The cell inhibition rate of proliferation of different concentrations of carboplatin alone on rat ovarian cancer transgenic cell line T1,T2 and T3 was less than 30%;the rate was more than 30% after combination use of carboplatin and curcumin (P<0.05);the effect on T2 and T3 which was transfected with AKT was more obvious.The expression of K-RAS,PI3K (p-PI3K) and AKT (p-AKT) in T1,T2 and T3 of combination group was lower than that of carboplatin group.Conclusion Rat ovarian cancer transgenic cell lines T1,T2 and T3 are resistant to carboplatin.Curcumin can reverse the drug resistance to carboplatin,especially for T2 and T3 cells which contain AKT.The reverse effect of curcumin may be related to the inhibition of the expression of K-RAS,PI3K and AKT or direct inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

Curcumin;Carboplatin;Ovarian cancer

2017-01-13

中國醫科大學附屬盛京醫院病理科，沈陽 110004

遼寧省科技攻關計劃項目(2013225021)；遼寧省“百千萬人才工程”資助項目(2011921040)；沈陽市科技創新專項資金(F14-231-1-46)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706004

*通信作者