高壓處理誘發(fā)蝦原肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系

胡志和，王星璇，張晴青，吳子健，薛 璐，賈 瑩

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

高壓處理誘發(fā)蝦原肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系

胡志和，王星璇，張晴青，吳子健，薛 璐，賈 瑩

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

以凡納濱對(duì)蝦原肌球蛋白為原料，研究不同高壓條件下引發(fā)構(gòu)象的變化與致敏性的關(guān)系。采用不同高壓條件（壓力0.1～800.0 MPa，處理時(shí)間10～40 min，溫度10～37 ℃）處理原肌球蛋白（tropomyosin，TM），用圓二色譜法檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，熒光光度法檢測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)致敏性。結(jié)果顯示，超高壓處理能夠引發(fā)TM的致敏性和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，而對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)無顯著影響；高壓條件下TM致敏性的變化與其三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變有顯著相關(guān)性。在實(shí)驗(yàn)壓力范圍內(nèi)，20 ℃、300 MPa處理40 min TM疏水性氨基酸暴露程度最小，且致敏性最低（OD492nm為0.210±0.005）；700 MPa條件下暴露程度最高，且致敏性最高（OD492nm為0.328±0.004）。因此，TM致敏性與其三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)無關(guān)。

凡納濱對(duì)蝦；原肌球蛋白；超高壓處理；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；致敏性

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又稱為南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei），是一種被廣泛食用、肉鮮味美且營養(yǎng)價(jià)值高的商品蝦[1]。然而，該蝦也是主要的過敏性食物之一[2-3]。研究表明，原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是蝦類等甲殼動(dòng)物的主要過敏原[4-9]。L. vannamei TM亞基的一級(jí)結(jié)構(gòu)由284 個(gè)氨基酸殘基組成，其中，親水性殘基含量較為豐富，約占66.2%，疏水性殘基約占33.8%，TM蛋白分子質(zhì)量約為36 ku[10]，其中蛋白部分的分子質(zhì)量約為32.849 ku，其他部分為糖基，其等電點(diǎn)pI為4.72，整個(gè)亞基的脂溶指數(shù)為79.12，是一種熱穩(wěn)定性蛋白[11]。TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成以α-螺旋為主[10,12-13]，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由TM的亞基進(jìn)一步相互纏繞形成天然狀態(tài)下的卷曲之卷曲螺旋二聚體結(jié)構(gòu)[14-16]。

TM作為致敏性蛋白，其空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）的改變，會(huì)引起致敏性[17-18]的改變。在研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法中，超高壓技術(shù)是普遍采用的方法之一。超高壓（ultra high pressure，UHP）技術(shù)，又稱高靜壓（high hydrostatic pressure，HHP）技術(shù)是指將樣品密封在容器內(nèi)，以水或油作為傳壓介質(zhì)，在常溫或較低的溫度條件下，用100 MPa以上的壓力（100～1 000 MPa）處理，使蛋白質(zhì)等高分子化合物中的非共價(jià)鍵（包括氫鍵、離子鍵、疏水作用力等）發(fā)生變化[19-20]，改變其空間結(jié)構(gòu)，從而改變其功能特性。Penas等[21-22]在200 MPa和300 MPa條件下處理大豆蛋白可大幅度降低其致敏性。Husband等[23]研究了熱和高壓對(duì)蘋果的2 個(gè)主要過敏原（Mal d 1、Mal d 3）及Bet v 1（類似芹菜中過敏原Api g 1）的影響，發(fā)現(xiàn)通過加熱或提高壓力可以有效降低其主要過敏原。

本研究采用超高壓處理凡納濱對(duì)蝦的主要過敏原TM，研究不同處理?xiàng)l件下引發(fā)TM構(gòu)象的變化與致敏性的關(guān)系，為利用超高壓技術(shù)生產(chǎn)低致敏性蝦仁提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對(duì)蝦的TM（純度為97.65%） 天津商業(yè)大學(xué)食品專業(yè)實(shí)驗(yàn)室制備；苯胺基萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene-sulfonate，ANS）、兔抗南美白對(duì)蝦TM-IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體美國Sigma公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑（均為分析純） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；3590康寧96 孔酶標(biāo)板 美國Corning Costar公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MOS-450/AF-CD圓二色譜儀 法國Biologic公司；F-4600熒光分光光度計(jì) 日立高新技術(shù)公司；HHP.L2-800/2.5超高壓實(shí)驗(yàn)機(jī) 天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；SpectraMax190光吸收酶標(biāo)儀 美國美谷分子儀器有限公司；FDU-810型冷凍干燥機(jī) 日本東京理化公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品超高壓處理

將TM樣品用超純水配制成2 mg/mL的蛋白溶液，分裝于聚乙烯塑料袋，真空密封后，在不同壓力條件下（壓力0.1～800.0 MPa、處理時(shí)間40 min、處理溫度20 ℃）進(jìn)行處理，以常壓（0.1 MPa）處理的TM作為對(duì)照。處理后的樣品凍干備用。

1.3.2 圓二色性光譜檢測(cè)處理后TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)

委托天津大學(xué)化工學(xué)院分析測(cè)試中心，采用圓二色性光譜（circular dichroism spectrum，CD）檢測(cè)[24-25]TM樣品在190～250 nm范圍內(nèi)的變化。用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液將高壓處理的樣品稀釋成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的蛋白溶液，溶液樣品經(jīng)過0.2 μm濾膜處理后裝樣，防止雜散光對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響；樣品去氣，有效防止氣泡生成。儀器參數(shù)設(shè)置：采用2 mm光徑，掃描速率為60 nm/min，帶寬為1 nm，溶液上樣體積為0.2～0.5 mL，用Bio-Logic圓二色譜儀在室溫條件下記錄光譜。CD檢測(cè)3 次，得到遠(yuǎn)紫外光區(qū)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)摩爾殘基橢圓值，結(jié)果取平均值，用[θ]×103（（deg·cm2）/dmol）表示。用在線分析程序dichroweb（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)含量（采用SELCON3算法）。

1.3.3 苯胺基萘磺酸熒光探針法檢測(cè)TM的表面疏水性

根據(jù)Wang Xiansheng等[26]的方法并稍作改動(dòng)，使用疏水熒光探劑ANS，測(cè)定TM的疏水性。用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）將各條件下處理的TM樣品配制為質(zhì)量濃度500 ?g/mL的溶液，在4 mL樣品溶液中加入20 μL 5.0 mmol/L的ANS（10 mmol/L的磷酸鹽溶解）溶液，混合均勻后室溫放置反應(yīng)1 h，在激發(fā)波長380 nm、發(fā)射波長400～650 nm條件下用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.4 間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TM的致敏性

根據(jù)Tong Ping等[27]的方法并作修改。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)致敏性。將處理的TM用pH 9.6的Na2CO3/ NaHCO3緩沖液配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，向酶標(biāo)板中每孔加入100 μL，4 ℃條件下包被26 h。棄掉抗原稀釋液，用PBST（1 000 mL pH 7.4的磷酸鹽溶液中含1 mL吐溫20）洗液洗板，拍干后每孔加入封閉液（含1%的牛血清白蛋白的PBST溶液）200 μL，37 ℃條件下保溫2.5 h。棄去封閉液，用PBST洗液洗板，拍干。每孔加入100 μL抗體溶液（兔抗南美白對(duì)蝦TM-IgG抗體，用封閉液1∶750稀釋），37 ℃條件下孵育2 h。棄去孔中液體，用 PBST洗液洗板。每孔加100 μL二抗溶液（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體用封閉液1∶1 000稀釋），37 ℃條件下孵育1 h。棄去孔中液體，用PBST洗液洗板，拍干。每孔加入100 μL底物液（0.1 mol/L 檸檬酸4.86 mL，0.2 mol/L Na2HPO45.14 mL，加4 mg鄰苯二胺，再加3% H2O250 μL），37 ℃條件下閉光放置15 min，然后每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液。用酶標(biāo)儀在492 nm波長處檢測(cè)其OD492nm值。按照以下公式計(jì)算致敏性消減率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)操作，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，處理結(jié)果均以±s表示，圖表制作利用軟件Origin 8.6和Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)TM致敏性的影響

2.1.1 處理壓力對(duì)TM致敏性的影響

圖1 在20 ℃不同壓力下處理40 min對(duì)TM致敏性的影響Fig. 1 Effects of different pressure treatments at 20 ℃ for 40 min on TM allergenicity

將TM在20 ℃、不同壓力（0.1～800.0 MPa）條件下處理40 min，其致敏性變化見圖1。與0.1 MPa處理的TM致敏性（OD492nm為0.276±0.004）相比，在100～300 MPa壓力范圍內(nèi)，隨著壓力增加，TM致敏性逐漸降低，在300 MPa時(shí)最低，其OD492nm為0.210±0.005，致敏性消減率約為23.91%；當(dāng)壓力在300～700 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的升高，TM的致敏性逐漸增大，當(dāng)壓力為700 MPa時(shí)TM致敏性最高（OD492nm為0.328±0.004）；當(dāng)壓力在700～800 MPa范圍內(nèi)，致敏性隨壓力升高，又逐漸降低，且在800 MPa時(shí)其致敏性低于對(duì)照組。該現(xiàn)象的原因，可能是由于在不同壓力下，TM的抗原表位暴露程度發(fā)生變化，從而導(dǎo)致致敏性的變化[28-29]。

2.1.2 處理時(shí)間對(duì)TM致敏性的影響

TM在20 ℃、400 MPa條件下分別處理10、20、30、40 min，采用間接ELISA測(cè)定處理后TM的免疫原性，見圖2。與對(duì)照組（OD492nm為0.276±0.004）比較，處理時(shí)間為20 min時(shí)TM免疫原性最低，其OD492nm為0.187±0.005，消減率約為32.73%。在10～20 min范圍內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長，TM致敏性逐漸降低；在20～40 min范圍內(nèi)，隨時(shí)間的延長，TM的致敏性逐漸升高。因此，處理時(shí)間能對(duì)蝦TM的致敏性產(chǎn)生影響。

圖2 20 ℃ 400 MPa條件下不同處理時(shí)間對(duì)TM致敏性的影響Fig. 2 Effects of different treatment times at 20 ℃ and 400 MPa on TM allergenicity

2.1.3 處理溫度對(duì)TM致敏性的影響

圖3 400 MPa不同溫度條件下處理40 min對(duì)TM致敏性的影響Fig. 3 Effects of different temperatures at 400 MPa for 40 min on TM allergenicity

TM在400 MPa和不同溫度（10、20、30 ℃和37 ℃）條件下處理40 min，其致敏性的變化如圖3所示。采用壓力為400 MPa處理40 min條件下，在10～30 ℃范圍內(nèi)，隨著處理溫度的升高TM致敏性呈升高趨勢(shì)，10 ℃時(shí)，其致敏性最低（OD492nm為0.132±0.005），與未處理蛋白相比，致敏性消減率為52.6%，在30 ℃處理時(shí)其致敏性達(dá)到最高（OD492nm為0.258±0.002）；當(dāng)溫度升高為37 ℃時(shí)其致敏性下降（OD492nm為0.152±0.001），與未處理相比，致敏性消減45.32%。該變化趨勢(shì)體現(xiàn)了壓力與溫度對(duì)蛋白變性影響的復(fù)雜性，與Balny等[30]的研究結(jié)果相似。

2.2 超高壓處理對(duì)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 壓力對(duì)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖4 不同壓力條件下20 ℃處理40 min對(duì)蝦TM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effect of different pressure treatments for 40 min at 20 ℃ on secondary structure of TM

TM在不同壓力（0.1～800 MPa）條件下20 ℃處理40 min，用CD遠(yuǎn)紫外光譜測(cè)定TM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量，通過Dichroweb在線分析軟件分析計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量（采用SELCON3算法）。根據(jù)未處理TM（0.1 MPa）CD譜圖（圖4）的特征，遠(yuǎn)紫外區(qū)（185～245 nm），在191～193 nm波長處有正吸收峰，在210 nm波長處和221～222 nm波長處分別有負(fù)吸收峰，屬于典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。在217～218 nm和195～197 nm波長處無明顯吸收峰的存在，說明其β-折疊相對(duì)含量很小；在192.5 nm波長處無負(fù)吸收峰，在200～205 nm波長范圍內(nèi)，是正吸收和負(fù)吸收過渡范圍，但無明顯吸收峰的變化，并且在227 nm波長處無吸收峰，因此，β-轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量較少；在195～202 nm范圍內(nèi)，存在正吸收和負(fù)吸收的過渡，但無明顯峰的變化，在230 nm波長處無明顯負(fù)吸收峰，因此，無規(guī)卷曲的相對(duì)含量較少。根據(jù)Dichroweb在線分析軟件分析計(jì)算，未處理TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量分別為：α-螺旋約占80.4%、β-折疊占0%、β-轉(zhuǎn)角約占5.2%、無規(guī)卷曲約占14.4%。該結(jié)果與Jin Yafang等[31]測(cè)定Todarodes pacif i cus TM二級(jí)結(jié)構(gòu)含量一致（α-螺旋約占81%，不規(guī)整二級(jí)結(jié)構(gòu)約占19%）；而與自優(yōu)化預(yù)測(cè)法（self-optimized prediction method，SOPM）[12]預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成（α-螺旋約占95.07%、而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量分別為0.70%、1.76%、2.46%）的結(jié)果稍有差別。其原因可能時(shí)所有軟件的差異。

經(jīng)過不同壓力（100～800 MPa）處理后，雖然光譜圖有所變化，但圖形趨勢(shì)基本一致。在各波長下出峰的位置及結(jié)構(gòu)沒有變化（圖4A），經(jīng)過在線分析軟件計(jì)算的各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量（圖4B）與對(duì)照組（0.1 MPa組）相比，無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.2 保壓時(shí)間對(duì)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

TM在20 ℃、400 MPa條件下分別處理10、20、30 min和40 min，其CD譜圖及二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化見圖5。與未處理TM（0.1 MPa）相比，經(jīng)不同時(shí)間處理后TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量（圖5B）無顯著變化（P＞0.05）。

圖5 在20 ℃ 400 MPa條件下處理不同時(shí)間對(duì)蝦TM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Effect of different treatment times at 400 MPa and 20 ℃ on secondary structure of TM

2.2.3 處理溫度對(duì)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

將TM在不同溫度（10、20、30、37 ℃）條件下，400 MPa處理40 min，其CD譜圖及二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化見圖6。與對(duì)照組（0.1 MPa）相比，不同溫度條件下處理的TM二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量無顯著變化（P＞0.05）（圖6B）。

圖6 不同溫度、400 MPa條件下處理40 min對(duì)蝦TM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Effect of different temperatures at 400 MPa for 40 min on TM secondary structure

因此，在不同的高壓條件下處理凡納濱對(duì)蝦TM，其二級(jí)結(jié)構(gòu)無顯著變化。該結(jié)果與Nolwennig等[18]的研究結(jié)果一致，雖然其研究所用的TM是采用基因重組技術(shù)獲得，但其結(jié)果表明TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)是相對(duì)穩(wěn)定的。

由于不同高壓條件下處理的TM二級(jí)結(jié)構(gòu)無顯著變化，而處理后TM的致敏性發(fā)生了顯著變化（圖1～3）。因此，可以推論，高壓處理后TM致敏性的變化與其二級(jí)結(jié)構(gòu)無關(guān)。

2.3 超高壓處理TM氨基酸微環(huán)境的變化與致敏性關(guān)系

采用疏水熒光探劑ANS測(cè)定不同高壓條件處理的TM的疏水性變化，表征高壓條件處理后TM三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí)，與相同處理?xiàng)l件下TM致敏性進(jìn)行比較，揭示二者的關(guān)系。

2.3.1 壓力引發(fā)TM氨基酸微環(huán)境變化與致敏性的關(guān)系

圖7 不同壓力20 ℃條件下處理40 min對(duì)蝦TM熒光強(qiáng)度的影響Fig. 7 Effects of different pressure treatments at 20 ℃ for 40 min on fluorescence intensity of TM

在20 ℃不同壓力（0.1～800 MPa）條件下處理40 min，TM熒光圖譜和表面疏水性氨基酸的熒光強(qiáng)度變化如圖7所示。與0.1 MPa處理樣品相比，在100～300 MPa范圍內(nèi)，TM的熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，表明其表明疏水性氨基酸的數(shù)量逐漸減少；在300～700 MPa范圍內(nèi)，其熒光輕度呈上升趨勢(shì)，只有壓力大于600 MPa，其熒光強(qiáng)度才大于0.1 MPa的樣品組，700 MPa達(dá)到最高；當(dāng)壓力在700～800 MPa范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。因此，壓力對(duì)TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)有影響；隨著壓力的變化，呈現(xiàn)較好的規(guī)律性。

圖8 壓力引發(fā)TM三級(jí)結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系Fig. 8 Relationship between tertiary structure changes of TM caused by ultra-high pressure and its allergenicity

不同壓力處理后，TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與致敏性的關(guān)系見圖8。在0.1～300 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的增大，致敏性隨之減小，并且其熒光強(qiáng)度同樣呈減小的趨勢(shì)；在300～700 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的變化升高，其致敏性逐漸增大，700 MPa達(dá)到最高，而TM的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)。因此，在實(shí)驗(yàn)的壓力范圍內(nèi)，TM的致敏性與其三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.3.2 處理時(shí)間引發(fā)TM氨基酸微環(huán)境變化與致敏性的關(guān)系

圖9 在20 ℃、400MPa條件下處理不同時(shí)間對(duì)TM熒光強(qiáng)度的影響Fig. 9 Effects of different treatment times at 400 MPa and 20 ℃ on fluorescence intensity of TM

在20 ℃、400 MPa條件下，分別處理10、20、30、40 min，TM的熒光強(qiáng)度變化見圖9。當(dāng)處理時(shí)間在10～20 min范圍，隨著處理時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度從559.3±8.4下降至494.5±7.4，表明其疏水性氨基酸數(shù)量逐漸減少；當(dāng)處理時(shí)間在20～40 min范圍，隨時(shí)間延長，熒光強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢(shì)（從494.5±7.4增至595.5±6.8）；在20 min時(shí)熒光強(qiáng)度最低。因此，處理時(shí)間對(duì)TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)有影響。

圖10 處理時(shí)間引發(fā)TM三級(jí)結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系Fig. 10 Relationship between tertiary structure changes of TM at different treatment times and its allergenicity

處理不同時(shí)間后TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)與相同條件下處理TM的致敏性的關(guān)系見圖10。在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)，TM三級(jí)結(jié)構(gòu)變化與其致敏性的強(qiáng)弱呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。因此，TM的致敏性與三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.3.3 處理溫度引發(fā)TM氨基酸微環(huán)境變化與致敏性的關(guān)系

在400 MPa和不同溫度（10、20、30、37 ℃）條件下，處理40 min，TM的熒光強(qiáng)度變化如圖11所示。當(dāng)溫度在10～30 ℃范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度隨著溫度提高而增強(qiáng)（468.4±5.5增至604.5±6.9）；當(dāng)溫度在30～37 ℃范圍內(nèi)，其熒光輕度隨溫度升高而降低。因此，處理溫度對(duì)TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)有影響。

圖11 在400 MPa不同溫度條件下處理40 min對(duì)TM熒光強(qiáng)度的影響Fig. 11 Effects of different temperatures at 400 MPa for 40 min on fluorescence intensity of TM

圖12 處理溫度引發(fā)TM三級(jí)結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系Fig. 12 Relationship between tertiary structure changes of TM induced by different temperatures and its allergenicity

在不同溫度條件下處理的TM三級(jí)結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系見圖12。在實(shí)驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)，TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)與致敏性的變化趨勢(shì)一致。因此，TM的致敏性與其三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

因此，綜合各高壓條件氨基酸微環(huán)境的變化，處理壓力、時(shí)間及溫度均對(duì)TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。該影響可能與TM具有較高的可塑性區(qū)域比例[13-14]有關(guān)。另外，TM的致敏性與三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3 結(jié) 論

不同超高壓條件（壓力、溫度、時(shí)間）下處理凡納濱對(duì)蝦的TM，能夠引發(fā)其致敏性和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，而對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)無影響。各高壓條件下TM致敏性的變化與其三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變存在顯著的相關(guān)性，而與二級(jí)結(jié)構(gòu)無關(guān)。

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Relationship between Conformational Changes Caused by Ultra-high Pressure and Allergenicity of Shrimp Tropomyosin

HU Zhihe, WANG Xingxuan, ZHANG Qingqing, WU Zijian, XUE Lu, JIA Ying
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, School of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The objective of this work was to research the relationship between the conformational changes and allergenicity of tropomyosin (TM) from the white shrimp Litopenaeus vannamei after ultra-high pressure. TM was treated under different conditions of pressure (0.1–800.0 MPa), holding time (10–40 min) and temperature (10–37 ℃) and then tested for changes in it secondary and tertiary structures and allergenicity by circular dichroism spectrum (CD), fluorospectrophotometry and indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), respetively. Results showed that both the allergenicity and tertiary structure rather than the secondary structure of TM were changed under different high pressure conditions. There was a significant correlation between the changes in the allergenicity and tertiary structure of TM under different high pressure conditions. In the pressure range tested, the number of surface-exposed hydrophobic amino acids was the lowest at 20 ℃, 40 min, 300 MPa while achieving minimal allergenicity (OD492nmwas 0.210 ± 0.005), and the largest number of exposed hydrophobic amino acids and the maximal allergenicity (OD492nmwas 0.328 ± 0.004) were observed at 700 MPa. Therefore, the allergenicity of TM was related to its tertiary structure but not its secondary structure.

Litopenaeus vannamei; tropomyosin; ultra-high prssure treatment; protein conformation; allergenicity

10.7506/spkx1002-6630-201711006

TS254

A

1002-6630（2017）11-0033-07

胡志和, 王星璇, 張晴青, 等. 高壓處理誘發(fā)蝦原肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(11): 33-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711006. http://www.spkx.net.cn

HU Zhihe, WANG Xingxuan, ZHANG Qingqing, et al. Relationship between conformational changes caused by ultra-high pressure and allergenicity of shrimp tropomyosin[J]. Food Science, 2017, 38(11): 33-39. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711006. http://www.spkx.net.cn

2016-10-27

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271841）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD12-5049）

胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)閷Ｓ霉δ苁称贰-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn