棉籽抗菌活性肽的分離純化及鑒定

韓曉燕，包郁明，辛鳳姣，黃 穎，Christophe BLECKER，戴小楓,*

（1.中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，農業(yè)部農產品加工重點實驗室，北京 100193；2.列日大學食品學院，比利時 列日 999013）

棉籽抗菌活性肽的分離純化及鑒定

韓曉燕1，包郁明1，辛鳳姣1，黃 穎1，Christophe BLECKER2，戴小楓1,*

（1.中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，農業(yè)部農產品加工重點實驗室，北京 100193；2.列日大學食品學院，比利時 列日 999013）

通過體外模擬消化系統(tǒng)對棉籽分離蛋白（cottonseed protein isolate，CPI）進行酶解，得到具有抗菌活性的酶解產物，并采用超濾（ultraf i ltration，UF）、陰離子交換色譜（anion exchange chromatography，AEC）、半制備高效液相色譜（semi-preparation high performance liquid chromatography，semi-P-HPLC）分離技術對棉籽抗菌活性肽進行分離純化，用電噴霧串聯質譜（electrospray ionization-tandem mass spectrometry，ESI-MS/MS）鑒定棉籽抗菌肽的氨基酸序列。在抗菌活性肽分離純化過程中，用UF對具有抗菌活性的CPI酶解產物進行分離，得到3 個組分U-Ⅰ～U-Ⅲ。抗菌活性檢測表明U-Ⅲ的抗菌能力最強；用AEC分離U-Ⅲ得到3 個組分QF-Ⅰ～QF-Ⅲ，其中QF-Ⅱ抗菌能力最強；進一步采用semi-P-HPLC分離QF-Ⅱ得到4 個組分PF-Ⅰ～PF-Ⅳ，其中PF-Ⅲ的抗菌能力最強，經HPLC檢測為單一峰，ESI-MS/MS檢測分析得到該肽的氨基酸序列為ISGLIyEETR（Ile-Ser-Gly-Leu-Ile-Tyr-Glu-Glu-Thr-Arg）。

棉籽分離蛋白酶解產物；抗菌活性肽；分離純化；氨基酸序列

抗菌活性肽作為對抗病原體入侵的第一道防線，具有相對分子質量小、殺菌廣譜、抗菌活性高等特點，對動物與人尤其是嬰兒的免疫系統(tǒng)起著重要作用[1-2]，自20世紀80年代發(fā)現第一個抗菌活性肽——天蠶素后[3]，大量的天然抗菌活性肽相繼被發(fā)現，且結構得到鑒定[4-6]。天然抗菌肽因其安全性和廣譜性，作為抗菌產品在醫(yī)藥、生物等領域已有廣泛應用[7]。

近年來，植物蛋白來源的生物活性肽作為功能因子引起了各國學者的廣泛關注。我國是產棉大國，棉籽產量穩(wěn)居世界首位（2015年約為750萬 t），棉籽蛋白含量豐富，關于其酶解消化得到棉籽生物活性肽的研究具有重要意義。目前關于棉籽活性肽的研究主要集中在抗氧化活性[8-9]及血管緊張素轉化酶抑制活性[10]，而在抗菌活性方面的研究鮮有報道。本實驗采用超濾（ultrafiltration，UF）、陰離子交換色譜（anion exchange chromatography，AEC）及半制備高效液相色譜（semipreparation high performance liquid chromatography，semi-P-HPLC），對具有抗菌活性的棉籽分離蛋白體外模擬消化的酶解產物進行分離純化。超濾是按分子質量大小對物質進行分級和濃縮的一種技術[11]，由于其簡單輕便易操作[12]，常被用于生物活性肽制備的第一步分離技術[13]，離子交換色譜是根據樣品表面所帶電荷的不同而對其進行分離的，不同物質因其表面凈電荷不同，與帶相反電荷填料之間相互作用能力的強弱不同從而被結合或洗脫[14]。HPLC是根據樣品極性的不同對其進行分離的，靈敏度較高，常作為樣品分離純化的最后一步[15]。

生物活性肽結構鑒定主要包括氨基酸序列分析儀測定法[16]和質譜（mass spectrometry，MS）法[17]，目前，在小肽結構鑒定方面應用較多的是基質輔助激光解吸電離（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI）-MS[18]和電噴霧（electrospray ionization，ESI）-MS技術[6,19]。在ESI-MS中，高分子質量的物質通常會帶有多個電荷，電荷狀態(tài)的分布可以精確對分子質量定量，并且可以同時提供精確的分子質量和結構信息，這是ESI-MS相對于其他電離質譜所特有的優(yōu)點[20]。因此本實驗選用ESI-MS/MS對純化得到的棉籽抗菌活性肽的氨基酸序列進行鑒定，為棉籽蛋白的精深加工及功能性棉籽肽的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉籽分離蛋白（cottonseed protein isolate，CPI）本課題組自制[21]；金黃色葡萄球菌 中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌 中國農業(yè)科學院農產品加工研究所棉花病害防治實驗室。

Tris Base 美國Sigma公司；鹽酸、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；三氟乙酸（色譜純） 薩恩化學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

超濾管（10 kD及3 kD） 美國Millipore公司；5810 R型及5424 R型離心機 德國Eppendorf公司；UC-6 200型超聲波清洗器 美瑞泰克科技有限公司；AKTA Pure型蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；Prostar 218 LC型semi-P-HPLC儀、1200 LC型HPLC儀美國安捷倫公司；Arium Comfort型超純水儀 德國賽多利斯公司；Easy-nLC 1000型納升級液相色譜儀、Q Exactive型質譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 棉籽蛋白酶解產物制備

準確稱取5.0 g棉籽分離蛋白粉，加入250 mL蒸餾水配制成2%的蛋白溶液，加入胃蛋白酶5 000 U/g底物，在37 ℃，pH 2.0條件下酶解2 h，用0.9 mol/L NaHCO3溶液調節(jié)pH值至5.3，加入胰蛋白酶5 000 U/g底物后，用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至7.6，37 ℃恒溫振蕩酶解2 h，100 ℃滅酶10 min終止消化反應，并參照鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）法[22]測定其水解度。

冷凍干燥所得酶解產物，用滅菌水（121 ℃，高壓蒸汽滅菌21 min）溶解，配成100 mg/mL的酶解產物溶液，用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌，檢測其抗菌活性，并作為進一步實驗樣品備用。

1.3.2 抗菌活性測定

參考王娣等[23]報道的濾紙片-瓊脂擴散法，以50 μg/mL的抗生素卡那霉素（kanamycin，Kan）為對照測定酶解產物及分離所得不同組分的抗菌活性。

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床過夜培養(yǎng)，用紫外分光光度計在600 nm波長處調節(jié)菌懸液光密度（optical density，OD）值至1，即菌落形成約為1×108CFU/mL，再稀釋1 000 倍（逐步依次稀釋10 倍，稀釋3 次），備用。

取熔化的LB固體培養(yǎng)基及營養(yǎng)肉汁-瓊脂培養(yǎng)基約20 mL倒入無菌培養(yǎng)皿中，水平放置，待其凝固后，在培養(yǎng)皿底部標記菌種及濾紙片的擺放位置等。取100 μL菌液均勻涂布于相應固體培養(yǎng)基上，待菌液完全滲入培養(yǎng)基后，在不同的標記位置上放上對應藥液浸泡后的濾紙片，重復3 次。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，測定抑菌圈直徑大小，以此為指標確定抗菌能力。

1.3.3 UF分離

將具有抗菌活性的棉籽蛋白酶解產物依次經過截流分子質量（MW）為10 kD和3 kD UF膜進行離心超濾[24]， 4 000 r/min，離心50 min，將酶解液按分子質量大小分為3 部分：U-Ⅰ（MW≥10 kD）、U-Ⅱ（10 kD＞MW≥3 kD）及U-Ⅲ（3 kD＞MW）。收集每部分的超濾液，真空冷凍干燥得到各組分肽粉，用滅菌水（121 ℃，高壓蒸汽滅菌21 min）將所得各組分的肽粉配制成質量濃度為50 mg/mL的溶液，并檢測其抗菌活性（檢測方法見1.3.2節(jié)），選取抗菌活性最強的組分作為進一步分離純化樣品。

1.3.4 AEC分離

對UF后抗菌活性較強的組分進行AEC分離純化，其純化條件如下：色譜柱：QFF 1 mL GE；緩沖液：A為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），B為含1 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；波長：220 nm；進樣量：約為4 mL；流速：1 mL/min；洗脫條件：先用緩沖液A洗脫15 個體積，然后采用緩沖液B從0%～100%梯度洗脫20 個體積，再用A洗脫5 個體積。

收集每個洗脫峰，真空冷凍干燥，配成10 mg/mL的溶液，并檢測每個洗脫峰的抗菌活性，選取抗菌活性最強的峰組分作為進一步分離純化樣品。

1.3.5 semi-P-HPLC分離

semi-P-HPLC對AEC得到的活性最高的組分進一步分離純化，其分離條件為：色譜柱：Innoval C18（21.2 mm×250 mm，4.5 μm）；洗脫液A：含0.5%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）超純水（超聲處理15 min，以除去氣泡），洗脫液B：乙腈；波長：220 nm；進樣量：1 mL；流速：10 mL/min；采用梯度洗脫：0～50 min，洗脫液B從5%逐漸升至20%，A相應從95%降至80%；50～55 min，用20% B及80% A進行洗脫；55.0～55.1 min，洗脫液B從20%降至5%，A相應從80%升至95%；55.1～60.0 min，5% B及95% A洗脫5 min。

收集分離的單一峰，進行真空冷凍干燥，測定每個收集峰的抗菌活性，并用HPLC檢測其純度。

1.3.6 抗菌肽純度檢測

使用分析型HPLC對分離純化出的棉籽抗菌活性肽進行純度檢測，色譜條件如下：色譜柱：Innoval C18（ 4.6 mm×250 mm，4.5 μm）；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；流速：1 mL/min；流動相：含0.1% TFA的超純水和乙腈；洗脫條件：5%～10%乙腈梯度洗脫30 min。

1.3.7 抗菌肽的氨基酸結構測定

首先采用毛細管HPLC對抗菌活性肽進行脫鹽處理，色譜條件如下：色譜柱：Column Technology Inc RP-C18（0.15 mm×120 mm，1.9 μm）；流動相：A為含0.1%甲酸的水溶液，B為含0.08%甲酸的80%乙腈溶液；檢測波長：220 nm；柱溫：300 ℃；進樣量：5 μL；流速：600 nL/min；采用梯度洗脫：0～8 min，洗脫液B從6%逐漸升至9%，A相應從94%降至91%；8～24 min，洗脫液B從9%逐漸升至14%，A相應從91%降至86%；24～60 min，洗脫液B從14%逐漸升至30%，A相應從86%降至70%；60～75 min，洗脫液B從30%逐漸升至40%，A相應從70%降至60%；75～78 min，洗脫液B從40%升至95%，A相應從60%降至5%；78～85 min，95% B及5% A進行洗脫；85～86 min，洗脫液B從95%降至6%，A相應從5%升至94%；86～90 min，6% B及94% A進行洗脫。

酶解產物經毛細管HPLC脫鹽及分離后用Q Exactive質譜儀進行質譜分析。檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：m/z 50～750；多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：一級質譜在m/z 200時分辨率為70 000；一級延遲時間：10 ms；每次全掃描后采集10 個碎片圖譜；二級在m/z 200時分辨率為17 500；二級最大延遲時間：60 ms。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 體外模擬消化酶解CPI

體外模擬消化所得C P I酶解產物的水解度為（24.72±1.07）%，對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌都有一定的抗性，其抑菌圈直徑大小分別為（1.10±0.06） cm和（0.80±0.08） cm，對其進行進一步的分離純化。

2.2 UP結果

表1 酶解物UP后各組分抑菌圈直徑Table 1 Inhibitory zone diameters of ultrafiltration fractions of cottonseed protein hydrolysates

將具有抗菌活性的CPI酶解產物，依次通過10 kD、 3 kD分子截流量進行超濾，使其按分子質量大小分為U-Ⅰ、U-Ⅱ、U-Ⅲ，并通過濾紙片-瓊脂擴散法測定各組分的抗菌活性。通過抑菌圈大小看出U-Ⅲ對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有抗菌活性，其抑菌圈直徑分別為（1.17±0.03）cm和（0.76±0.03）cm，而另外兩個組分U-Ⅰ、U-Ⅱ對兩種菌均未發(fā)現抑制活性（表1）。因此，選擇抗菌活性最強的組分U-Ⅲ作為進一步分離純化的樣品。

2.3 AEC分析

使用AEC對U-Ⅲ進一步分離純化，根據出峰情況收集得到3 個洗脫峰：QF-Ⅰ、QF-Ⅱ、QF-Ⅲ，如圖1所示。

分離U-Ⅲ的洗脫圖譜Fig. 1 Elution profile of U-圖1 AECⅢ by AEC

表2 AEC分離U-Ⅲ所得組分抑菌圈直徑Table 2 Inhibitory zone diameters of fractions separated from U-Ⅲ by AEC

以抑菌圈直徑為指標，檢測收集的洗脫峰的抗菌活性。由表2可知，QF-Ⅰ對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（0.70±0.05） cm，而對大腸桿菌沒有抑制能力；QF-Ⅱ對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有較強的抗菌能力，其抑菌圈直徑分別為（1.25±0.06） cm和（1.10±0.04） cm，顯著高于QF-Ⅰ和QF-Ⅲ（P＜0.05）。因此，選擇QF-Ⅱ進行抗菌肽的進一步分離純化。

2.4 semi-P-HPLC分析

使用semi-P-HPLC技術對AEC所得的抗菌活性最強的組分QF-Ⅱ進行分離純化，得到4 個主要肽峰PF-Ⅰ、PF-Ⅱ、PF-Ⅲ及PF-Ⅳ（圖2）。

圖2 semi-P-HPLC分離純化QF-Ⅱ圖譜Fig. 2 Semi-preparative HPLC profile of QF-Ⅱ

表3 semi-P-HPLC分離QF-Ⅱ所得組分抑菌圈直徑Table 3 Inhibitory zone diameters of four fractions separated from QF-Ⅱ by semi-preparative HPLC

由表3可知，抗菌活性測定結果表明PF-Ⅲ的抑菌活性最強，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（1.13±0.07） cm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為（1.14±0.05） cm。PF-Ⅳ對大腸桿菌的抑菌圈直徑為（0.97±0.08） cm，而對金黃色葡萄球菌未見抑制活性。

2.5 抗菌肽純度分析

采用HPLC對抗菌活性肽PF-Ⅲ純度進行檢測結果如圖3所示，其純度（峰面積）在95%以上，可對其進行氨基酸序列分析。

圖3 棉籽抗菌肽PF-Ⅲ的HPLC圖譜Fig. 3 HPLC chromatogram of PF-Ⅲ

2.6 抗菌肽的氨基酸序列結果

圖4 PF-Ⅲ的ESI-MS/MS圖Fig. 4 ESI-MS/MS spectrum of PF-III

在ESI-MS/MS儀中，利用能量場對帶電多肽離子進行轟擊使其氨基酸序列斷裂形成多肽片段離子，得到PF-Ⅲ二級質譜圖（圖4），根據碎片離子的斷裂位置，片段離子可以分成6 種，即N端的a、b、c離子和C端的x、y、z離子，通常以b、y離子讀出氨基酸序列，片段離子匹配容差為20 mmu。通過氨基酸序列分析圖譜（圖5）分析得到，該棉籽抗菌活性肽PF-Ⅲ的氨基酸序列為ISGLIyEETR（Ile-Ser-Gly-Leu-Ile-Tyr-Glu-Glu-Thr-Arg）。

圖5 PF-Ⅲ氨基酸序列分析圖Fig. 5 Amino acid sequence analysis

3 討 論

通過分子截流量為10 kD和3 kD的UF膜對棉籽分離蛋白的酶解產物進行分級得到U-Ⅰ（MW≥10 kD）、U-Ⅱ（10 kD≥MW≥3 kD）及U-Ⅲ（3 kD≥MW）3 個組分，所得組分的抗菌活性檢測結果顯示分子質量最小的UF組分（U-Ⅲ）抗菌活性最強，這與研究報道的抗菌活性肽分子質量較小相一致[13]。進一步采用AEC對U-Ⅲ進行分離得到3 個洗脫峰QF-Ⅰ、QF-Ⅱ及QF-Ⅲ，其中QF-Ⅱ的抗菌能力最強。采用semi-P-HPLC從QF-Ⅱ中分離純化得到4 個洗脫峰，抗菌活性檢測結果顯示PF-Ⅲ的抗性最強，進一步使用分析型HPLC對其純度進行分析，為單一峰，ESI-MS/MS分析得到其氨基酸序列為ISGLIyEETR。

盡管對抗菌活性肽做了大量研究[25-26]，但其確切的作用機制尚不明確，可能是促使細胞形成跨膜孔[27]，抑制細胞壁或核酸的合成[28]，或者激活宿主細胞內的自溶酶系統(tǒng)從而抑制細菌的生長繁殖[29-30]，因此可根據該抗菌活性肽的氨基酸序列進行化學合成，并對其抗菌機制展開研究。

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Purification and Identification of Antibacterial Peptides from Cottonseed Protein Isolate Hydrolysates

HAN Xiaoyan1, BAO Yuming1, XIN Fengjiao1, HUANG Ying1, Christophe BLECKER2, DAI Xiaofeng1,*
(1. Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Department of Food Science, University of Liège, Liège 999013, Belgium)

Cottonseed protein isolate (CPI) was digested in vitro to prepare hydrolysates with antibacterial activity. Ultrafiltration (UF), anion exchange chromatography (AEC), and semi preparative high performance liquid chromatography (semi-P-HPLC) were used to isolate and purify antibacterial peptides from CPI hydrolysates, and the purified peptides were sequenced by electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). During the purification process, CPI hydrolysates were separated into three fractions: U-Ⅰ, U-Ⅲ and U-III by UF and the obtained U-Ⅲ, with higher antibacterial ability, was further separated into QF-Ⅰ, QF-Ⅱ and QF-Ⅲ by AEC. After filtration, QF-Ⅱ, which showed higher antibacterial ability, was further fractionated using semi-P-HPLC into four subfractions: PF-Ⅰ, PF-Ⅱ, PF-Ⅲ and PF-Ⅳ, among which, PF-Ⅲ was determined to have the highest antibacterial activity. The purity of PF-Ⅲ showed a single peak in HPLC. Finally, by ESI-MS/MS, and the amino acid sequence of the peptide was identified as ISGLIYEETR (Ile-Ser-Gly-Leu-Ile-Tyr-Glu-Glu-Thr-Arg).

cottonseed protein isolate hydrolysates; peptide with antibacterial activity; isolation and purification; amino acid sequence

10.7506/spkx1002-6630-201711020

TS201.3

A

1002-6630（2017）11-0122-06

韓曉燕, 包郁明, 辛鳳姣, 等. 棉籽抗菌活性肽的分離純化及鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 122-127. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711020. http://www.spkx.net.cn

HAN Xiaoyan, BAO Yuming, XIN Fengjiao, et al. Purification and identification of antibacterial peptides from cottonseed protein isolate hydrolysates[J]. Food Science, 2017, 38(11): 122-127. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711020. http://www.spkx.net.cn

2016-05-18

科技部國際科技合作項目（2016-X31）

韓曉燕（1989—），女，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：hanxiaoyan131@126.com

*通信作者：戴小楓（1962—），男，研究員，博士，研究方向為加工有害生物防控。E-mail：daixiaofeng@caas.cn