桉葉精油包埋前后抑菌性能及成分比較研究

岳淑麗，任小玲，陳 霞，向 紅，孫遠明*，凌舒琦，劉薈雅

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

桉葉精油包埋前后抑菌性能及成分比較研究

岳淑麗，任小玲，陳 霞，向 紅，孫遠明*，凌舒琦，劉薈雅

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

以包埋前后的桉葉精油為研究對象，采用平板打孔法和氣相擴散法分別測定其對供試菌的抑菌活性和氣相最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、氣相最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），探討桉葉精油包埋前后抑菌性能差異。并用氣相色譜-質譜聯用技術對比分析桉葉精油包埋前后的化學成分。結果表明：桉葉精油包埋前后對供試細菌、酵母菌和霉菌均有一定的抑制作用。對酵母菌的抑制作用最強，其次為細菌，對霉菌的抑制效果稍差。桉葉精油包埋前后對供試菌的氣相MIC和MBC未有太大差異。桉葉精油包埋前后主要成分大體相同，均以萜烯類和醇類化合物為主。包埋后桉葉精油中部分萜烯類化合物的消失或相對含量的減少導致抑菌性能稍有下降，但氣相MIC不變，僅對釀酒酵母和桔青霉的氣相MBC稍有上升。

桉葉精油；包埋；抑菌性能；氣相擴散；化學成分

YUE Shuli, REN Xiaoling, CHEN Xia, et al. Comparative study of antimicrobial activity and composition of eucalyptus essential oil before and after encapsulation[J]. Food Science, 2017, 38(11): 155-160. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711025. http://www.spkx.net.cn

桉樹是桃金娘科（Myrtaceae）桉樹屬（Eucalyptus）植物，是世界上著名的速生樹種，原產于澳大利亞，在我國廣東、廣西、海南、云南等地種植廣泛[1-2]。從桉樹枝葉中提取的桉葉精油對細菌、真菌、昆蟲等均有不同程度的抑制作用，被廣泛應用于食品、農業、化工、醫藥等各個行業，具有較大的應用價值和開發前景[3-5]。但桉葉精油易揮發、不便運輸與貯藏，高濃度的純精油具有腐蝕性，直接接觸會對操作者造成一定的傷害[6]。采用微膠囊技術對桉葉精油進行包埋，可將液態的精油轉變成固體粉末，提高其穩定性[7]，同時利用壁材的透氣性可實現桉葉精油的緩釋抑菌效果[8]，使其便于作為天然食品抑菌保鮮劑使用。但包埋過程中的溫度、光、氧氣等都會對精油造成一定程度的影響，導致其成分及各成分含量發生變化，這些變化是否顯著，對精油的抑菌性能是否會造成較大影響的相關研究國內外還鮮有報道。葛昕等[9]在研究復合茶油微膠囊時發現微膠囊化工藝中的高溫處理會對油脂的活性物質造成一定程度的破壞，但具體破壞程度如何并未涉及。黃國清等[10]在研究大蒜油微膠囊時發現與未包埋的大蒜油相比，包埋后大蒜油的主要成分僅損失了甲基烯丙基二硫醚，保留了大蒜油中的主要有效成分，且各成分含量變化不大，但未有涉及包埋前后大蒜油的抑菌性能差異。Leimann等[11]采用水蒸氣蒸餾法提取包埋后的檸檬香茅精油，研究其抑菌性能和成分，并與包埋前的純精油作對比，發現包埋后檸檬香茅精油的主要抑菌成分含量變化不大，對供試菌的最低抑菌濃度無影響，但對包埋前后檸檬香茅精油抑菌性能的研究不夠全面，也未深入研究成分變化對抑菌性能的具體影響。

本實驗對桉葉精油包埋前后的抑菌活性和氣相最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、氣相最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）進行研究，并采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術測定桉葉精油包埋前后的化學組成，深入探討成分變化對抑菌性能產生的影響。以期為利用桉葉精油開發天然食品抑菌保鮮劑提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、桔青霉（Penicillium citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）均由華南農業大學食品學院生物工程系提供。

桉葉精油 廣州市帕塞佳香精香料有限公司；β-環糊精 上海博奧生物科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉（均為分析純） 南京化學試劑股份有限公司；營養瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；牛肉浸膏 國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司；施保克（咪鮮胺有效成分含量為250 g/L） 美國富美實公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀 安捷倫科技有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-250-Ⅱ生化培養箱 廣東省醫療器械廠；DHG-9055A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SB-100DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸氣滅菌鍋 上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 包埋后桉葉精油樣品的提取

采用飽和水溶液法[12-13]制備桉葉精油β-環糊精微膠囊。參考2010版《中國藥典》附錄XD揮發油測定法（甲法）[12,14]蒸餾提取包埋后的桉葉精油。但為減少提取時長時間加熱對精油成分的破壞，做如下修改：將制備的桉葉精油微膠囊置于錐形瓶中，在錐形瓶中加入適量去離子水，攪拌均勻，加蓋密封，在超聲波清洗機中于40 ℃超聲振蕩20 min。再將其轉移至裝有數粒玻璃珠的500 mL圓底燒瓶中，加水至圓底燒瓶中約含300 mL去離子水，連接揮發油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加去離子水使充滿揮發油測定器的刻度部分，并剛好溢流入燒瓶時為止。用調溫電熱器加熱至微沸，此時燒瓶中振蕩析出的桉葉精油很快冷凝至揮發油測定器中，立即停止加熱，收集此時揮發油測定器中的桉葉精油作為包埋后的桉葉精油備用。

1.3.2 菌懸液的制備

參照文獻[15]的方法，在超凈工作臺上用接種環挑取適量已活化的供試菌到裝有9 mL無菌水的試管中，充分混合，用無菌移液槍吸取1 mL混合后的菌懸液于另一支裝有9 mL無菌水的試管中，依次制成系列濃度的菌懸液。細菌采用平板計數法，霉菌和酵母菌采用顯微鏡直接計數法。根據計數結果，將菌懸液濃度調至106～107CFU/mL，備用[15]。

1.3.3 抑菌活性的測定

通過測定桉葉精油對供試菌的抑菌圈大小來考察桉葉精油的抑菌活性，采用平板打孔法[16-17]測定。待培養基（細菌用營養瓊脂培養基，霉菌及酵母用PDA培養基）冷卻至45 ℃左右，在直徑為12 cm的玻璃培養皿內倒入約40 mL培養基。待培養基凝固后，用無菌移液槍吸取供試菌懸液100 μL于相應培養基上，并用無菌三角玻璃棒涂布均勻。待菌液被吸收后，用直徑為9 mm的無菌槍頭在培養基上均勻打4 個孔，用無菌鑷子剔去孔內培養基，用無菌移液槍吸取一滴液體培養基封底。對于不同的菌，4 個孔中加入的供試液及添加量分別為：細菌及酵母菌在4 個孔內分別注入10 μL包埋前、后的桉葉精油、相同體積的施保克原液和無菌水；桔青霉在4 個孔內分別注入50 μL包埋前、后的桉葉精油、相同體積的體積分數為0.2%的施保克和無菌水；黑曲霉在4 個孔內分別注入100 μL包埋前、后的桉葉精油、相同體積的0.1%施保克和無菌水。其中施保克和無菌水分別作為陽性和陰性對照。每個菌種分別做3 次重復。

以上操作均在無菌條件下進行。然后將培養皿放入生化培養箱中培養（細菌在37 ℃條件下恒溫培養20 h，酵母菌在28 ℃條件下恒溫培養48 h，霉菌在28 ℃條件下恒溫培養4～5 d）。培養結束，用十字交叉法測量各抑菌圈直徑，結果取平均值，以抑菌圈大小來表示抑菌活性。

抑菌圈的判定標準[18-19]：直徑＞20 mm ，極敏；15～20 mm，高敏；10～14 mm，中敏；7～9 mm，低敏；直徑＜7 mm，不敏感。

1.3.4 氣相MIC及MBC的測定

采用氣相擴散法[20-21]，在直徑為9 cm的玻璃培養皿內倒入15 mL冷卻至 45 ℃左右的培養基，待其完全冷卻凝固后，將100 μL濃度為106～107CFU/mL的菌懸液均勻涂抹其上。菌液被吸收后倒置放置，用移液槍吸取不同量包埋前、后的桉葉精油到皿蓋中央，使細菌和酵母菌培養皿中精油空間含量分別為12.5、25、50、100、200 μL/L，霉菌培養皿中精油空間含量分別為50、100、200、400、800 μL/L（9 cm培養皿去除培養基后的體積約為100 mL），以不添加桉葉精油的培養皿為空白對照。迅速蓋好培養皿并用封口膜密封，置于生化培養箱中培養（細菌37 ℃、20 h，酵母菌28 ℃、48 h，霉菌28 ℃、4～5 d），每組3 個平行。以完全不長菌的培養皿所對應的含量為桉葉精油對該菌的氣相MIC。之后，在無菌條件下，用滅菌過的皿蓋替換完全不長菌的培養皿皿蓋繼續培養相同的時間，再以完全不長菌的培養皿所對應的含量為桉葉精油對該菌的氣相MBC。

1.3.5 桉葉精油包埋前后成分測定

采用GC-MS技術對包埋前后的桉葉精油成分進行測定。其中包埋前的桉葉精油為不經任何處理的桉葉精油，包埋后的桉葉精油為1.3.1節中提取的桉葉精油。

氣相色譜條件[22]：HP-5MS石英毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；初始柱溫60 ℃，以5 ℃/min的速率升至150 ℃，再以4 ℃/min的速率升至230 ℃（保持1 min）；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進樣量0.2 μL；進樣口溫度250℃；分流比50∶1。

質譜條件[22]：EI離子源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250℃；質量掃描范圍30～400 u，采用全掃描方式。

采用標準NIST14譜庫進行相似度比對，參考標準圖譜和相關文獻確認各組分，利用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 桉葉精油包埋前后抑菌活性

表1 桉葉精油包埋前后對供試菌的抑菌圈直徑（±s）Table 1 Inhibition zone diameters of eucalyptus essential oil before and after microencapsulation against tested microorganisms (±s)

表1 桉葉精油包埋前后對供試菌的抑菌圈直徑（±s）Table 1 Inhibition zone diameters of eucalyptus essential oil before and after microencapsulation against tested microorganisms (±s)

注：孔徑（9 mm)包含在測量結果中，0表示無抑菌圈形成。

樣品大腸桿菌 金黃色葡萄球菌桔青霉黑曲霉釀酒酵母桉葉精油（包埋前）37.5±1.725.7±1.834.2±1.629.6±1.638.9±0.2桉葉精油（包埋后）27.2±2.616.3±0.721.9±2.522.7±2.024.9±1.0施保克29.5±1.023.6±1.036.9±2.147.0±2.334.2±2.0無菌水00000

由表1可知，桉葉精油包埋前后對供試菌均有一定的抑菌活性。包埋前的桉葉精油在10 μL時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的抑菌圈直徑均大于20 mm，屬極敏感水平；在50 μL時對桔青霉的抑菌圈直徑為34.2 mm，達到極敏感水平；在100 μL時對黑曲霉的抑菌圈直徑為29.6 mm，達到極敏感水平。包埋后的桉葉精油在10 μL時對大腸桿菌和釀酒酵母的抑菌圈直徑均有所下降，但都大于20 mm，仍為極敏感水平；在10 μL時對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為16.3 mm，屬高敏水平；在50 μL時對桔青霉的抑菌圈直徑為21.9 mm，屬極敏感水平；在100 μL時對黑曲霉的抑菌圈直徑為22.7 mm，屬極敏感水平。包埋后的桉葉精油對供試菌的抑菌活性有所下降，但仍具有較好的抑菌效果。陽性對照施保克對供試菌的抑菌圈直徑均大于20 mm，屬極敏感水平，但施保克作為果蔬保鮮劑使用時一般需稀釋至500×10－6～1 000×10－6g/mL[23-24]，而在此質量濃度下施保克對細菌和酵母菌幾乎無抑菌效果。

總體來看，桉葉精油包埋前后均對釀酒酵母的抑制效果最好，其次是兩種細菌，效果稍差的是霉菌，即桉葉精油對對細菌和酵母菌的抑制作用要好于霉菌，這與吳慧清等[25]的研究結果基本一致。桉葉精油包埋后抑菌效果稍有下降，但對供試菌的抑菌活性仍達到極敏或高敏水平，說明桉葉精油具有廣譜抑菌性，其作為天然食品保鮮劑具有潛在優勢。

2.2 桉葉精油包埋前后氣相MIC及MBC

表2 桉葉精油包埋前后對供試菌的氣相MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of eucalyptus essential oil before and after encapsulation against tested microorganisms

由表2可知，桉葉精油包埋前后對釀酒酵母的氣相MIC最低，均為25 μL/L；對兩種細菌的氣相MIC和MBC均相同，分別為50 μL/L和100 μL/L；對霉菌的抑制效果稍差，尤其是黑曲霉，氣相MIC及MBC達到了400 μL/L。包埋后的桉葉精油對供試菌的氣相MIC不變，僅對釀酒酵母和桔青霉的氣相MBC稍有上升。說明包埋過程并未對桉葉精油的抑菌性能造成明顯影響，包埋后的桉葉精油仍具有較好的抑菌效果。較低劑量的桉葉精油即可殺死食品中常見的腐敗菌，說明桉葉精油作為食品抑菌保鮮劑使用時不需要太大劑量，對食品風味不會造成太大影響。實驗中桉葉精油不直接與供試菌接觸，在密閉空間內以揮發性氣體的形式即對供試菌起到抑菌及殺菌作用[26]，說明可采用微膠囊緩釋的方式發揮桉葉精油的抑菌保鮮作用，桉葉精油作為食品抑菌保鮮劑的安全性得到進一步的提高。

2.3 桉葉精油包埋前后成分

圖1 包埋前（A）、后（B）桉葉精油的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of eucalyptus essential oil before (A) and after (B) microencapsulation

為明確桉葉精油的成分及包埋前后的成分差異，采用GC-MS技術對桉葉精油包埋前后的成分進行分析，得到桉葉精油包埋前后的總離子流圖如圖1所示。將圖1中分離出的各組分提取質譜圖，用NIST14標準譜庫進行檢索，參考標準圖譜和相關文獻確定各組分的化學結構，并采用峰面積歸一化法確定各組分的相對百分含量[4,27-29]，結果見表3。

包埋前的桉葉精油共檢測出51 種物質，鑒定出其中39 種成分，占總離子流出峰面積的98.906 6%。其中萜烯類化合物（76.497 2%）22 種、醇類化合物（21.540 2%）13 種、烷烴類化合物（0.810 8%）3 種、酚類化合物（0.058 4%）1 種。含量較高的化合物有蒎烯（17.734 3%）、右旋檸檬烯（14.702 5%）、1,4-桉葉素（11.065 0%）、異松油烯（9.358 6%）、鄰傘花烯（8.741 2%）、崁烯（7.497 5%）、1,8-桉葉素（7.417 5%）、（+）-3-蒈烯（6.308 7%）、α-松油烯（4.993 5%）、γ-松油烯（2.082 9%）、α-水芹烯（1.721 3%）、β-月桂烯（1.158 7%）。萜烯類和醇類化合物是桉葉精油的主要化學成分，這與前人研究結果[4,30-31]基本相符。

表3 包埋前、后桉葉精油的化學成分及相對含量Table 3 Chemical components and their relative contents in eucalyptus essential oil before and after microencapsulation

包埋后的桉葉精油共檢測出41 種物質，鑒定出其中32 種成分，占總離子流出峰面積的99.250 5%。其中萜烯類化合物（72.369 5%）18 種、醇類化合物（26.168 7%）11 種、烷烴類化合物（0.712 3%）3 種。其中，含量較高的化合物有蒎烯（17.099 6%）、右旋檸檬烯（14.015 2%）、1,4-桉葉素（13.729 6%）、1,8-桉葉素（9.759 8%）、鄰傘花烯（9.410 8%）、崁烯（8.597 8%）、異松油烯（8.269 1%）、（＋）-3-蒈烯（5.452 9%）、α-松油烯（3.572 1%）、γ-松油烯（1.610 0%）、α-水芹烯（1.425 5%）、4-甲基-1-（1-甲基乙基）-環己烯（0.972 7%）、β-月桂烯（0.946 5%）。

由表3可知，包埋過程并未對桉葉精油的主要成分造成明顯影響，桉葉精油包埋前后均以萜烯類和醇類化合物為主。包埋后桉葉精油中有部分萜烯類、烷烴類和酚類化合物消失。萜烯類化合物的相對含量與包埋前相比有幾種成分的含量減少，但也有幾種成分的含量有所增加。部分醇類化合物如1,8-桉葉素、1,4-桉葉素的含量增加。植物精油的抑菌性能與其成分中的萜烯類、醇類、酚類、酮類、醛類等物質有關。本實驗測得包埋前后的桉葉精油中均含有萜烯類、醇類、酚類等物質，因此包埋前后的桉葉精油對供試菌均有不同程度的抑制作用。

結合2.1節和2.2節的結果說明桉葉精油的抑菌性能與其成分及成分含量有一定的關系，其抑菌成分并非一種物質，而是多種物質協同作用的結果[3,30,32]。桉葉精油中的萜烯類、醇類、酚類物質均具有一定的抑菌作用[30,33]。桉葉精油對供試菌具有較好的抑菌效果與蒎烯、傘花烯、檸檬烯、松油烯、崁烯和桉葉素等抑菌成分有關[3]。其中萜烯類物質對桉葉精油抑菌性能的發揮有較大影響[3,30,34]，包埋后的桉葉精油中部分萜烯類化合物的消失或相對含量的減少，使得包埋后的桉葉精油抑菌性能稍有下降，對釀酒酵母和桔青霉的氣相MBC稍有上升，但對所有供試菌的氣相MIC不變。包埋過程并未對桉葉精油的抑菌性能及成分造成明顯影響。

3 結 論

桉葉精油包埋前后對供試細菌、酵母菌和霉菌均有一定的抑制作用。對酵母菌的抑制效果最好，其次為細菌，對霉菌的抑制效果稍差。包埋后的桉葉精油抑菌活性稍有下降。桉葉精油包埋前后對供試菌的氣相MIC和MBC差別不大。包埋后的桉葉精油對供試菌的氣相MIC不變，僅對釀酒酵母和桔青霉的氣相MBC稍有上升。GC-MS分析結果表明，桉葉精油包埋前后主要成分大體相同，均以萜烯類和醇類化合物為主。桉葉精油的抑菌性能與蒎烯、傘花烯、檸檬烯、松油烯、崁烯和桉葉素等抑菌成分有關。包埋后桉葉精油中部分萜烯類化合物的消失或相對含量的減少，導致抑菌性能稍有下降。但包埋過程并未對桉葉精油的抑菌性能及成分造成明顯影響，包埋后的桉葉精油仍具有較好的抑菌效果。本研究為利用桉葉精油開發天然食品抑菌保鮮劑提供一定的參考。

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Comparative Study of Antimicrobial Activity and Composition of Eucalyptus Essential Oil before and after Encapsulation

YUE Shuli, REN Xiaoling, CHEN Xia, XIANG Hong, SUN Yuanming*, LING Shuqi, LIU Huiya
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

The antibacterial activity of encapsulated and non-encapsulated eucalyptus essential oil (EEO) was determined by the agar well diffusion method, and the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were studied by vapor diffusion method. Besides, the chemical composition was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the EEO had antibacterial activity against all tested bacteria, yeast and mold irrespective of encapsulation. Its antimicrobial activity against yeast was the strongest followed by bacteria, and its antimold activity was weaker. The MIC and MBC of EEO did not significantly differ before and after encapsulation, and the major chemical components were identical, including terpenes and alcohols. The disappearance or decrease of some terpenes in the essential oil after encapsulation resulted in a slight decrease in its antibacterial activity; while its MIC remained unchanged, its MBC against Saccharomyces cerevisiae and Penicillium citrinum was slightly increased.

eucalyptus essential oil; encapsulation; antibacterial properties; vapor diffusion; chemical composition

10.7506/spkx1002-6630-201711025

TS201；O629.6

A

1002-6630（2017）11-0155-06引文格式：

10.7506/spkx1002-6630-201711025. http://www.spkx.net.cn

2016-10-31

航天營養與食品工程重點實驗室開放基金資助項目（h2015631）

岳淑麗（1979—），女，講師，碩士，研究方向為食品包裝、功能性包裝材料。E-mail：ysl@scau.edu.cn

*通信作者：孫遠明（1956—），男，教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：ymsun@scau.edu.cn

岳淑麗, 任小玲, 陳霞, 等. 桉葉精油包埋前后抑菌性能及成分比較研究[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 155-160.