瑞士乳桿菌TS206對小鼠血脂及糞便膽汁酸水平的調控影響

王 泳，葉 雷，賈 彥，龐廣昌，趙 培，閆亞麗*，陳慶森*

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

瑞士乳桿菌TS206對小鼠血脂及糞便膽汁酸水平的調控影響

王 泳，葉 雷，賈 彥，龐廣昌，趙 培，閆亞麗*，陳慶森*

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

探討瑞士乳桿菌TS206（Lactobacillus helveticus TS206）對小鼠血脂水平的影響。以健康BABL/c小鼠為對象，設置實驗組和對照組，分別以L. helveticus TS206菌懸液和生理鹽水（0.2 mL/d）連續灌胃7 周，監測小鼠體質量和血脂（總膽固醇（total serum cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）水平、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C））以及糞便總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平的變化。灌胃L. helveticus TS206后，小鼠體質量增量顯著高于對照組（P＜0.05，P＜0.01）；血清中TC、TG和LDL-C水平均顯著降低（P＜0.05），灌胃停止1 周后基本恢復到對照組水平；L. helveticus TS206菌懸液和生理鹽水小鼠血清中HDL-C含量均無顯著性變化；TBA水平呈先下降后上升趨勢，且3 周后TBA水平顯著低于對照組（P＜0.05）。研究結果表明，L. helveticus TS206能促進健康小鼠體質量增加，并有效調控其血脂水平，提示口服L. helveticus TS206菌劑可能會降低患心腦血管疾病的風險。

瑞士乳桿菌TS206；血脂；總膽汁酸；心腦血管疾病

引文格式：

王泳, 葉雷, 賈彥, 等. 瑞士乳桿菌TS206對小鼠血脂及糞便膽汁酸水平的調控影響[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 196-201. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711031. http://www.spkx.net.cn

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隨著人們生活水平的日益提高，各種高脂肪、高熱量、高膽固醇的食品充斥著人們的飲食，造成膽固醇代謝紊亂，嚴重威脅人們的身體健康。膽固醇的正常代謝是維持機體健康的關鍵因素之一，當血清膽固醇偏高時會增加肥胖、動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的風險。研究表明，在西方發達國家心腦血管疾病患者的死亡率排在第一位，預計到2030年，心腦血管疾病會涉及全球2000多萬人口[1]。目前通過改善飲食結構來控制膽固醇攝入量的方法效率較低，主要是由于低脂肪的飲食口感差，很難被消費者所接受。因此，尋找更加安全方便、易于接受的降膽固醇方法變得尤為重要[2]。

近年來，益生菌在人類營養與健康中的作用日益凸顯，而其對機體膽固醇代謝的影響也成為了國內外學者的研究焦點。20世紀70年代Mann等[3]就發現非洲土著居民飲用的含乳酸菌的發酵酸乳具有降低血清膽固醇的功能，且這些土著居民極少患高膽固醇血癥、心腦血管疾病和肥胖癥等。這些發現掀起了國內外益生菌調節血清膽固醇的研究熱潮。Alalin等[4]研究了普通酸奶和添加了嗜酸乳桿菌的酸奶對小鼠體質量增長、血清總膽固醇（total serum cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglycerides，TG）的含量以及糞便中乳桿菌及大腸菌群數量的影響，結果顯示嗜酸乳桿菌酸乳能顯著降低小鼠血清TC和LDL-C濃度。隨后，Satoshi等[5]發現含有瑞士乳桿菌的奶酪能有效減少大鼠腸系膜的脂肪組織總量及血清中LDL-C含量。Cavallini等[6]研究發現含有益生菌的豆醬能夠顯著降低機體血清中非HDL-C含量，增加血清中HDL-C等“好的”膽固醇含量，而且造成這種現象的原因可能是因為益生菌能夠調節腸道菌群的平衡，影響體內膽固醇代謝從而調節血清膽固醇含量，降低了心腦血管疾病的患病風險。Nguyen等[7]發現從新生嬰兒糞便中篩選出的Lactoballus plantum PH04能夠降低高脂血癥小鼠血清中TC含量和TG含量。Hossein等[8]研究表明，來源于嬰兒糞便中的Lactoballus plantum A7同樣能夠降低高脂模型小鼠血清TC含量和TG含量。

糞便中的膽汁酸來源于腸道細菌的代謝產物，目前越來越多的研究認識到腸道中膽汁酸水平與某些疾病之間的關系。Keating等[9]研究發現腸道膽汁酸除了可以促進脂類的消化吸收，其對腸道生理的調節也具有重要作用，如調節腸上皮穩態和腸屏障等功能；Ou等[10]通過探討高脂肪和高蛋白膳食對結腸癌發病風險的影響，發現糞便膽汁酸水平與結腸癌的發病相關；Duboc等[11]發現糞便膽汁酸與炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）發病相關，IBD患者的糞便膽汁酸含量顯著高于健康受試者。

前期研究已經表明Lactobacillus helveticus TS206能夠通過促進腸道有益菌增殖，抑制致病菌生長來維持腸道微生物區系的平衡[12]，并且能夠有效地調節腸黏膜免疫應答維護腸黏膜免疫平衡[13]。本研究在前期研究結論的基礎上開展L. helveticus TS206對健康小鼠血脂調控能力的研究，并結合腸道膽汁酸的研究更加全面地闡述益生菌對機體膽固醇代謝的影響。此外，本研究選取健康小鼠為研究對象，而不同于以往研究中建立的非常態模型，旨在探究L. helveticus TS206在個體常態下對機體血脂水平的影響，這將為健康個體攝取益生菌提供可靠的消費理念和依據，也將為進一步研究益生菌通過調節腸道菌群結構影響機體膽固醇代謝的機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

90 只6 周齡BABL/c雄性小鼠16～20 g，SPF級，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK（京）2009-0017；瑞士乳桿菌TS206（Lactobacillus helveticus TS206）由天津商業大學實驗室保藏。

TC測定試劑盒、TG測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒 北京北化康泰臨床試劑有限公司；總膽汁酸（total bile acid，TBA）測定試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；LD5-10低速離心機 北京醫用離心機廠；Spectra Max M5全自動酶標儀 美國Molecular Devices公司；DNP-9082電熱恒溫培養箱 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗與分組

90 只SPF級雄性BABL/c小鼠適應性喂養1 周后隨機分為對照組和實驗組，每組45 只；實驗組小鼠每天灌胃0.2 mL L. helveticus TS206菌懸液（菌體濃度3×108～4×108CFU/mL，參考文獻[14]的方法），對照組小鼠每天灌胃等量的生理鹽水；連續灌胃7 周，灌胃結束后再繼續自由飲食飲水飼養1 周；實驗期間各組小鼠均飼喂普通繁育飼料，自由進食和飲水。

1.3.2 小鼠生長狀態和體質量的測定

56 d動物實驗期間，每天觀察受試小鼠的生長狀態；每7 d稱1 次小鼠體質量，并分別在實驗第7、28、42、56天計算每組小鼠體質量增量。

1.3.3 樣本采集

分別在實驗開始后第0、7、14、21、28、35、42、49、56天，禁食不禁水12 h后，每組小鼠中隨機抽取5 只，眼球摘除取血，37 ℃條件下讓血液凝固1 h，4 ℃靜置2 h；再在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，得到血清分裝后－80 ℃冰箱保存備用。

1.3.4 小鼠血脂水平和糞便TBA水平的測定

1.3.4.1 小鼠血脂水平的測定

上述方法得到的各組小鼠血清按照試劑盒說明書分別檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量，并按式（1）計算動脈粥樣硬化指數（atherosclerotic index，AI）。

1.3.4.2 小鼠糞便中TBA含量的測定

將采集的小鼠糞便進行真空冷凍干燥，去除糞便中水分。取20 mg干燥后的小鼠糞便，加入1 mL叔丁醇溶液（體積比1∶100），渦旋混勻，37 ℃水浴15 min后渦旋混勻10 s，最后在4 ℃、10 000×g離心2 min取上清液。按照TBA試劑盒說明書測定上清液中TBA含量。

1.4 數據分析

用SPSS 19軟件對數據進行單因素方差分析和配對t檢驗分析；數據利±s表示；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 L. helveticus TS206對小鼠生長狀態和體質量的影響

TS206對小鼠體質量增量的影響Fig. 1 Effect of L. helveticus TS206 on body weight gain in mice圖1L. helveticus

由圖1可知，實驗期間從小鼠的生長狀態可以看出，與對照組相比，實驗組小鼠皮毛更加光滑鮮亮，精神更加活躍；兩組小鼠食欲正常，采食量并無顯著差異。圖1顯示的小鼠體質量增量的變化結果表明，實驗期間對照組與正常組小鼠的體質量都逐漸增加。灌胃7 d后，實驗組小鼠體質量增量顯著高于對照組（P＜0.05），并且一直持續到實驗結束，研究結束時實驗組小鼠體質量增量比對照組小鼠體質量增量高75.2%，差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 L. helveticus TS206對小鼠血脂水平的影響

2.2.1 L. helveticus TS206對小鼠血脂水平的影響

TS206對小鼠血脂水平的影響Fig. 2 Effect of L. helveticus TS206 on serum lipids in mice圖2L. helveticus

從圖2a可以看到，實驗第7天開始益生菌灌胃組小鼠血清TC濃度開始降低，到實驗第14、21天，益生菌灌胃組小鼠血清TC濃度顯著低于對照組（P＜0.05）；在實驗第28天，益生菌灌胃組小鼠血清TC濃度降到最低水平，此時益生菌灌胃組小鼠血清TC濃度與對照組相比降低了36%，差異具有極顯著性（P＜0.01）；此后幾周內益生菌灌胃組小鼠血清TC濃度緩慢升高但仍然顯著低于對照組（P＜0.05）；在灌胃第49天和停止灌胃后1周，雖然益生菌灌胃組小鼠血清TC濃度仍低于對照組9.7%，已無顯著性差異（P＞0.05）。結果說明，一定劑量的L. helveticus TS206可以顯著降低機體血清TC含量，并且隨攝入時間的延長這種作用更趨穩定。

由圖2b可知，灌胃7 d后益生菌灌胃組小鼠血清TG含量迅速降低，與對照組相比降低了59.5%，差異具有顯著性（P＜0.05）；在接下來的4 周內實驗組小鼠血清TG含量變化不大，但與對照組相比差異仍然極顯著（P＜0.01）；隨后，益生菌灌胃組小鼠血清TG含量開始緩慢上升，停止灌胃后1周（第56天），益生菌灌胃組小鼠血清TG含量相對于對照組升高了9.4%，但無顯著性差異（P＞0.05）。結果說明，L. helveticus TS206攝入初期可以迅速降低機體血清TG含量，但隨攝入時間的延長這種作用具有減弱的趨勢。

圖2c表明，實驗期間小鼠血清HDL-C含量變化不明顯；在實驗前3 周益生菌灌胃組小鼠血清HDL-C含量具有小幅度增加，但是與對照組相比這種幅度增加并沒有形成顯著性差異（P＞0.05），實驗后期兩組小鼠血清HDL-C含量基本穩定在同一水平。結果說明，灌胃L. helveticus TS206未能引起HDL-C水平的顯著變化，這可能與該菌的降膽固醇機制有關，但攝入一定劑量的L. helveticus TS206可能對維持機體HDL-C的正常水平具有重要作用。

圖2d顯示，實驗期間兩組小鼠血清LDL-C含量隨時間變化。在灌胃開始后的前14 d內，L. helveticus TS206灌胃組小鼠血清LDL-C含量迅速降低，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）；而從第21天開始，灌胃組小鼠血清LDL-C含量又恢復到與對照組無顯著差異的水平（P＞0.05），并且一直持續到實驗結束。結果說明，攝入L. helveticus TS206短期內可以迅速降低機體血清LDL-C水平，盡管沒有長期降低的作用，重要的是灌胃L. helveticus TS206可控制血清中LDL-C水平。

2.2.2 L. helveticus TS206對小鼠AI的影響

由圖3可以看到，L. helveticus TS206灌胃可以降低小鼠AI；在灌胃前4 周益生菌灌胃組小鼠AI持續降低，在實驗第28天降到最低，與對照組相比降低了76.9%，具有極顯著性差異（P＜0.01）；隨后，益生菌灌胃組小鼠AI有小幅度增加，但是在實驗第35、42天仍然顯著低于對照組（P＜0.05）；在灌胃第49天和停止灌胃后1 周，實驗組小鼠AI與對照組已無顯著差異（P＞0.05），但是相對于灌胃前降低了77.1%，仍處于較低水平。結果說明，L. helveticus TS206的攝入可以明顯降低機體動脈粥樣硬化的患病風險，且具有持續性效果。

TS206對小鼠AI的影響Fig. 3 Effect of L. helveticus TS206 on atherosclerotic index in mice圖3L. helveticus

2.3 瑞士乳桿菌對小鼠糞便TBA水平的影響

分別對益生菌灌胃組和對照組小鼠在灌胃后的第7、21、35、49天糞便中TBA進行測定，分析了L. helveticus TS206對小鼠TBA代謝的影響差異，結果如圖4所示。

TS206對小鼠TBA代謝的影響Fig. 4 Effect of L. helveticus TS206 on metabolism of TBA in mice圖4L. helveticus

由圖4可以看到，整體上小鼠糞便中TBA的水平波動較大，益生菌灌胃組小鼠表現為隨著灌胃時間延長TBA水平呈下降趨勢，而對照組小鼠表現為隨著灌胃時間延長TBA水平呈上升趨勢；在灌胃開始后7 d，兩組小鼠糞便中TBA水平并無明顯差異（P＞0.05），而在灌胃后第21天，對照組小鼠糞便中TBA水平顯著高于實驗組（P＜0.05），而且隨著灌胃時間的延長，這種差異表現得越顯著，在灌胃第35天和第49天，對照組小鼠糞便中TBA水平極顯著高于實驗組（P＜0.01）。

3 討論與結論

臨床上治療高膽固醇血癥的方法主要是通過服用他汀類、貝特類、膽酸結合樹脂類化學藥品，但這些藥物作用不穩定，長期服用會引發肝臟受損等副作用，且價格昂貴。因此，尋找能夠調節血清膽固醇含量，緩解并治療高膽固醇血癥的生物制劑具有十分廣闊的應用前景。

本研究給健康小鼠連續灌胃一定劑量的L. helveticus TS206后，發現灌胃L. helveticus TS206的小鼠體質量增量顯著高于對照組（P＜0.05），這可能是由于L. helveticus TS206進入或定殖在小鼠腸道后，使小鼠原有的菌相結構發生了改變，促進了乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌大量繁殖并定殖，減少腸桿菌類、腸球菌類等條件致病菌的數量，營造了小鼠腸道微生物的平衡狀態，從而幫助提高機體腸道對營養物質的吸收，增強機體腸黏膜免疫和抗過敏作用[12-15]。由此，灌胃L. helveticus TS206小鼠較對照組小鼠生長狀態更好，體質量增加較快。因此，猜測L. helveticus TS206能夠通過維系腸道微生態的平衡，在健康范圍內促進小鼠的營養代謝，從而改善小鼠生活狀態，促進體質量的增加。

目前，國內外學者認為益生菌能夠降膽固醇的機理主要包括以下幾個方面：1）腸道細菌中的部分乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌等菌株能產生膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH），催化由肝臟合成的結合型膽汁鹽產生去結合型膽汁鹽并與血清中的膽固醇發生共沉淀從而降低膽固醇含量[16-17]；2）益生菌能夠從周圍環境中吸收膽固醇至菌體細胞，從而降低膽固醇的含量[18]；3）乳酸菌中部分菌株能夠產生膽固醇還原酶，可以通過將膽固醇轉變為糞固醇而排出體外[19]。在本研究中灌胃L. helveticus TS206后小鼠血清中TC、TG和LDL-C等各項與心腦血管疾病發病風險成正相關的指標的水平均在一定程度上得到了降低。El-Gawad[20]、Chiu[21]、王輯[22]等均研究發現相關益生菌能夠顯著降低機體血清中“壞膽固醇”的含量，與本實驗結果相似。究其原因，可能是由于L. helveticus定殖于小鼠腸道后調整了腸道內菌群結構的消長，具有促進腸內短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）等有機酸分泌的菌種有效繁殖和提升，從而抑制膽固醇合成過程中關鍵酶的活性，降低了小鼠血清膽固醇含量[23-24]；也可能是通過腸道內細胞信號通路途徑控制脂蛋白受體的活性，從而有助于降低血清膽固醇水平[25]。到目前為止，益生菌調節腸道微生物與機體膽固醇代謝的確切關系仍需要進一步研究驗證。HDL-C被稱為“好膽固醇”，對心血管具有保護作用。在本實驗過程中未發現灌胃L. helveticus TS206能夠顯著升高小鼠血清HDL-C的含量，這可能與菌種降膽固醇機制以及實驗動物喂養的飼料成分組成有關。本研究通過引入AI的指標，進行判斷動脈粥樣硬化性冠脈疾病的危險狀態，能夠反映心血管疾病的易患程度，隨著AI的減小，患冠脈疾病的危險性相應降低。從小鼠AI的分析結果可以揭示，灌胃一定劑量的L. helveticus TS206，7 d后小鼠AI顯著降低，持續近30 d；表明長期適宜劑量的L. helveticus TS206的攝入對預防心血管疾病的發生具有重要作用。研究提示，AI的降低可能是由于L. helveticus TS206的攝入造成機體血清中TC含量降低，使得HDL-C的相對量升高，導致膽固醇運出動脈壁的量相對大于運進動脈壁的量，從而降低心血管疾病的發生率。

膽汁酸是通過膽固醇在肝臟中經過復雜的酶促反應而合成，它對于腸道中膳食脂肪和脂溶性維生素的吸收非常重要[26]。初級膽汁酸在腸道中能夠促進脂類消化吸收，同時，腸道微生物與膽汁酸共代謝使其轉變為次級膽汁酸，刺激膽汁酸通過相關細胞受體質量吸收回肝臟，經肝細胞處理后，與新合成的結合膽汁酸再進入腸道完成膽汁酸的肝腸循環[27]。因此，腸道菌群對膽汁酸代謝的調控作用對相關疾病例如脂肪吸收不良、肥胖和Ⅱ型糖尿病的發生和發展具有關鍵作用。

膽汁酸進入腸腔后與腸道微生物共代謝轉變為次級膽汁酸，而次級膽汁酸能夠導致大腸癌的發病風險[28]。而Zampa等[29]研究也證實，志愿者在補充Bif i dobacterium和Lactobacillus后糞便中的TBA含量顯著下降。另外已經有研究者證實益生菌能夠降低腸道內初級膽汁酸轉化為次級膽汁酸，從而可能抑制惡性腫瘤的發生發展[30]。在本研究中，發現灌胃L. helveticus TS206能夠降低小鼠腸道糞便內膽汁酸水平，對宿主的健康具有有益的作用，這與以上所報道的研究結果一致。對這一結論的分析可以提示，灌胃L. helveticus TS206菌劑可能會引起腸道內代謝膽汁酸的菌屬變化，使得膽汁酸代謝為次級膽汁酸的含量減少，也有利于降低血清中游離的膽固醇。

本研究通過給健康小鼠實施長期灌胃L. helveticus TS206的策略，監控小鼠體質量的變化，并檢測小鼠血清中血脂含量和糞便中TBA水平的變化，發現L. helveticus TS206能夠在健康范圍內促進小鼠的營養代謝，從而促進體質量明顯地增加；研究還揭示，消費108CFU/mL劑量的菌體，可有效地降低健康小鼠血清中“壞膽固醇”的含量，以及降低糞便中TBA的水平，表現出較為突出的降低心腦血管疾病的患病風險的特殊屬性，增加了L. helveticus TS206的開發價值；同時，本研究為進一步探討腸道菌群與機體脂類代謝相關性提供了一定的參考。

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Lactobacillus helveticus TS206 Regulates Serum Lipid Levels and Fecal Bile Acid Levels in Mice

WANG Yong, YE Lei, JIA Yan, PANG Guangchang, ZHAO Pei, YAN Yali*, CHEN Qingsen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to explore the effect of Lactobacillus helveticus TS206 on serum lipid levels in mice, health BABL/c mice were divided into two groups. One group was given L. helveticus TS206 bacterial suspension by gavage for 7 consecutive weeks while the other was gavaged with normal saline as control. Body weight, serum lipid levels including total serum cholesterol (TC), triglycerides (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and fecal total bile acid (TBA) levels were investigated in all mice. After the administration of L. helveticus TS206, body weight gains in mice were significantly higher than those in the control group (P ＜ 0.05, P ＜ 0.01), and the mean values of TC, TG and LDL-C were significantly decreased (P ＜ 0.05), which were restored to normal a week after the administration of L. helveticus TS206. There was no significant change in serum HDL-C concentrations between both groups (P ＞ 0.05). Fecal TBA concentration decreased in the intervention group, reaching a value significantly lower than that in the control group after three weeks of administration, while it increased in the control group. This study demonstrated that L. helveticus TS206 could promote body weight gain in healthy mice, and effectively regulate their serum lipid levels, suggesting that orally administered L. helveticus TS206 may reduce the risk of cardiovascular and cerebrovascular diseases.

Lactobacillus helveticus TS206; serum lipid; total bile acid; cardiovascular and cerebrovascular disease

10.7506/spkx1002-6630-201711031

TS201.3

A

1002-6630（2017）11-0196-06

2016-09-28

國家自然科學基金面上項目（31071522）；天津市科技創新體系及條件平臺建設項目（100005）

王泳(1993—），女，碩士研究生，研究方向為發酵生物技術、功能成分與腸道健康的關系。E-mail：15620616749@163.com

*通信作者：閆亞麗（1962—），女，副教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、微生物學。E-mail：yyali@tjcu.edu.cn陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為食源性生物活性物質與人類腸道健康、食品發酵與釀造技術。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn