土茯苓組方對急性肝衰竭大鼠保護作用的實驗研究

郭秋芳 趙康路 郭意男 葉衛江?

土茯苓組方對急性肝衰竭大鼠保護作用的實驗研究

郭秋芳 趙康路 郭意男 葉衛江?

目的 觀察土茯苓組方對急性肝衰竭（ALF）大鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白及細胞炎癥因子表達的影響，驗證其確切療效及防治急性肝衰竭的作用機制。方法 40只Wistar雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、土茯苓組及乙酰半胱氨酸組。土茯苓和乙酰半胱氨酸組造模前3d分別予土茯苓水煎液5ml/（kg·d）及乙酰半胱氨酸50mg/（kg·d）灌胃（土茯苓水煎液含生藥濃度2g/ml，乙酰半胱氨酸溶液濃度為1mg/ml），采用D-氨基半乳糖（D-GalN）/內毒素脂多糖（LPS）腹腔注射造成大鼠ALF模型。造模6h后，取血檢測血清天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）含量，采用酶聯免疫法（ELISA）檢測TNF-α、IL-6、IL-10，并開腹取大鼠肝組織，應用Western Blot實驗方法分別檢測肝組織中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達情況。結果 與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達均明顯升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達顯著下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達明顯顯著升高（P＜0.05）；與乙酰半胱氨酸比較，土茯苓組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達略高（P＞0.05），Bcl-2蛋白表達略低（P＞0.05）。結論 土茯苓可明顯減輕急性肝衰竭大鼠肝臟損傷，其作用機制可能與上調Bcl-2蛋白、下調Caspase-3蛋白，從而抑制細胞凋亡，以及干預促炎因子及抗炎因子有關。

急性肝衰竭 細胞凋亡 炎癥因子 土茯苓 大鼠

急性肝衰竭（ALF）是由多種因素引起的肝臟嚴重損害，未經肝臟移植者病死率＞90%［1-3］。肝細胞凋亡的發生受Fas/FasL、Bcl-2和Caspase-3蛋白家族等多因素的調節［4］。另外，促炎因子TNF-α、IL-6及抗炎因子IL-10在肝衰竭中同樣發揮重要作用［5-6］。臨床研究發現土茯苓組方可以明顯改善肝衰竭患者的癥狀及預后，但其作用機制尚不明確［7］。2015年5月至2016年6月作者通過實驗研究，觀察土茯苓對急性肝衰竭大鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白及細胞炎癥因子表達的影響，探討其防治急性肝衰竭的作用機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠40只，體重（200±20）g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。1.2 試劑和藥品 D-GalN購自美國Sigma公司；LPS購于美國Sigma-Aldrich公司；AST、ALT、TBIL檢測試劑盒、TNF-α、IL-6、IL-10試劑盒、Bcl-2 和Caspase-3試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司；土茯苓組方水煎濃縮含生藥濃度為2g/ml，土茯苓水煎液，置于冰箱4℃保存備用。

1.3 動物分組和給藥 Wistar大鼠40只，采用數字表法隨機分為正常對照組10只，模型組10只，土茯苓組10只，乙酰半胱氨酸組10只。土茯苓組大鼠造模前3d予土茯苓水煎液5ml/（kg·d）灌胃，乙酰半胱氨酸組造模前3d予乙酰半胱氨酸50mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水，1次/d。

1.4 造模方法 末次給藥1h后，模型組、土茯苓組及乙酰半胱氨酸組均予D-氨基半乳糖（D-GalN）

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比較 與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT和TBIL含量明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組大鼠血清AST、ALT和TBIL含量均明顯下降（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比較（x±s）

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比較 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組大鼠TNF-α、IL-6、IL-10均值均明顯降低，但土茯苓組與模型組大鼠TNF-α差異無統計學意義（P＞0.05），余均有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（x±s）

2.3 各組大鼠肝組織Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的比較 與正常組比較，模型組大鼠肝組織Bcl-2蛋白表達明顯下降，Caspase-3蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組Caspase-3蛋白表達均明顯下調，Bcl-2蛋白表達明顯上調（均P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠肝組織Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的比較

3 討論

研究表明，肝細胞凋亡在肝衰竭過程中發揮著重要作用，是肝衰竭過程中重要環節［8］，抑制肝細胞凋亡成為防治急性肝衰竭的重方法之一，同時強調細胞因子在ALF病理過程中的作用［9］，檢測其血清水平有助于判斷疾病嚴重程度及預后轉歸。Caspase是一組天門冬氨酸特異性的半胱酸蛋白酶，其活化是細胞凋亡的最終執行，在凋亡級聯激活中處于核心地位［10］。而Caspase-3的激活在肝細胞凋亡中起重要作用，Bcl-2可通過抑制Caspase-3的活性抑制細胞凋亡［11］。TNF-α、IL-6、 IL-10是ALF發病過程由肝臟內外的單核-巨釋系統釋放的細胞因子。其中TNF-α、IL-6可激活炎癥級聯反應，介導細胞損傷，是肝細胞急性炎癥反應的主要參與者，能較好的反映急性肝損傷的程度，而IL-10具有較強的抗炎及免疫抑制活性，在ALF中起著一定的保護作用［12］。D-GalN聯合LPS腹腔注射造成大鼠急性肝衰竭模型被國內外學者普遍認可及使用，造模6h后可見大量肝細胞凋亡，與臨床急性肝衰竭的發生機制相似，是研究急性肝衰竭細胞凋亡機制及細胞因子產生較理想模型［13］。

中醫無ALF的類似病名，根據身黃目黃伴神志昏蒙的癥狀，多納入“急黃”、“瘟黃”、“疫黃”及“肝厥”等范疇，對于肝衰竭病因的探討主要集中在毒、濕、熱、瘀、虛，病位于肝，橫連于膽，克伐脾胃，對于病機，急性和亞急性肝衰竭主要是疫毒熾盛、熱入營血、上擾心神，慢加急性肝衰竭主要為濕熱內蘊、脾氣虧虛、氣虛血瘀［14］；治療上以清熱、祛濕、解毒、開竅、健脾為普遍共識［15］。土茯苓組方（以土茯苓和玄參均100g以上為君藥的中藥組方）具有“祛濕通腑，排毒清肝”的功效。其中土茯苓主要功效為清熱利濕、解毒鎮痛，可選擇性地抑制細胞免疫［16］，玄參為“清熱解毒”常用藥，可明顯抑制肝細胞凋亡，上調Bcl-2蛋白表達，下調Fas/FasL表達［17］。

本資料結果表明，與正常組比較，模型組大鼠血清Caspase-3蛋白表達均明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯下降，表明Bcl-2蛋白表達與肝細胞凋亡呈負相關，Caspase-3蛋白表達與肝細胞凋亡呈正相關。土茯苓組AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達顯著下降，Bcl-2蛋白表達明顯顯著升高，提示土茯苓組方可減輕急性肝衰竭大鼠肝損害及抑制細胞凋亡，其機制可能與上調Bcl-2蛋白表達和下調Caspase-3蛋白表達有關。與乙酰半胱氨酸比較，土茯苓組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達略高（P＞0.05），Bcl-2蛋白表達略低（P＞0.05），進一步證實土茯苓組方可減輕急性肝衰竭大鼠肝損害及抑制細胞凋亡。

［1］ Bernal W, Wendon J. Acute liver failure. N Engl J Med, 2013, 369(26): 2525-2534.

［2］ Polson J, Lee W M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology, 2005, 41(5): 1179-1197.

［3］ Lee WM, Stravitz RT, Larson AM. Introduction to the revised American Association for the Study of Liver Diseases Position Paper on acute liver failure 2011. Hepatology, 2012, 55(3): 965-967.

［ 4］ Degterev A, Boyce M, Yuan J. A decade of caspases. Oncogene, 2003, 22(5 3): 8543-8567.

［5］ Yang Q, Shi Y, He J, et al. The evolving story of macrophages in acute liver failure. Immunol Lett, 2012, 147(1-2): 1-9.

［6］ Micheau O, Tschopp J. Induction of TNF receptor I-med iated apoptosis via two sequential signalin g complexes. Cell, 2003, 114(2): 181-190.

［7］ 鄧勤智,夏邦恩,王世和,等.土茯苓組方在乙型肝炎病毒慢加急性肝衰竭中的應用及療效分 析.中華中醫藥雜志, 2015(3): 739-742.

［8］ Mese H, Sasaki A, Nakayama S, et al. The role o f caspase famil y protease, caspase-3 on cisplatin-in duced apoptosis in cisplatinresistant A431 cell li ne. Cancer Chemother Pharma col, 2000, 46(3): 241-245.

［9］ 宋晨朝, 劉旭華, 陳煜, 等. 急 性肝衰竭大鼠TLR4 mRNA表達、血清腫瘤壞死因子-α、白介素-10及肝細胞凋亡的動態變化. 首都醫科大學學報, 2008(05): 580-584.

［10］ 鄧利娟,李湛軍,羅楹,等.Caspase抑制劑F1013對急性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡的影響.中國臨床藥理學與治療學,2010, 15(11): 1229-1233.

［11］ 王玉梅, 馮國和, 劉德剛, 等. Bcl-2蛋白及caspase-3基因表達與暴發性肝衰竭肝細胞凋亡關系的研究. 中國醫科大學學報, 2006, 35(5): 494-496.

［12］ 張文中,劉旭華,趙軍,等. 慢加急性肝衰竭大鼠血清TNF-α、白介素-10及肝細胞凋亡的動態變化.中國血液凈化, 2007(09): 496-499.

［13］ 王艷, 唐智敏. 急性肝衰竭動物模型的研究進展. 實驗動物科學, 2009, 26(2): 50-53.

［14］ 周小舟, 黃俏光, 孫新鋒, 等. 肝衰竭中醫證候分布規律研究.湖南中醫藥大學學報, 2013(01): 64-66.

［15］ 龍富立. 肝衰竭中醫病因病機及證候 學研究綜述.亞太傳統醫藥, 2015, 11(10): 53-54.

［16］ 王建平, 張海燕, 傅旭春. 土茯苓的化學成分和藥理作用研究進展. 海峽藥學, 2013(01): 42-44.

［17］ 張劉強, 李醫明. 近10年玄參屬植物化學成分和藥理作用研究進展. 中草藥, 2011(11): 2360-2368.

Objective To observer the effects of smilax prescription on expressions of Bcl-2，Caspase-3 and cytokines in rats with acute liver failure and to verify its exact effect and the possible mechanism. Methods Forty Wistar rats were divided into normal group，model group，smilax prescription group and acetylcysteine group. The smilax prescription group was given smilax prescription solution 10mg/（kg·d），the acetylcysteine group was given acetylcysteine 50mg/（kg·d），and 3 days consecutively. 1 hour after the last time，the acute liver failure model was reproduced in rats by peritoneal injection of D-Galactosamine（D-GalN）and lipopolysaccharide（LPS）. After 6 hours，the liver tissue of rats were taken out for Western Blot assay of Bcl-2 and Caspase-3 protein expressions，and TNF-α，IL-6，IL-10 in serum were detected by immunohistochemistry. Result Compared with the normal group，Bcl-2 protein expressions were signif i cantly decreased in the liver tissue of model group，and Caspase-3 protein expressions were significantly increased，the TNF-α、IL-6、IL-10 in serum were same to（P＜0.05）. Compared with the model group，Caspase-3 protein expressions and TNF-α，IL-6，IL-10 in the group of smilax prescription and acetylcysteine were signif i cantly down-regulated，while Bcl-2 protein expressions were signif i cantly up-regulated（P＜0.05）. Compared with the acetylcysteine group，Caspase-3 protein expressions and TNF-α，IL-6，IL-10 in the group of smilax prescription were slightly up-regulated，Bcl-2 protein expressions were slightly down-regulated（P＞0.05）.Conclusion Smilax prescription has protective effect on the apoptosis of rats with acute liver failure，and its possible mechanism may be related to up-regulated of Bcl-2 protein expressions，downregulated of Caspase-3 protein expressions to and intervention proinf l ammatory cytokines and anti-inf l ammatory cytokines.

Acute liver failure Apoptosis Smilax prescription Inf l ammatory cytokines Rat

310053 浙江中醫藥大學（郭秋芳 郭意男）322000 浙江大學醫學院附屬第四醫院（趙康路）310018 浙江省中醫院（葉衛江）

*通信作者800mg/kg，肉毒素脂多糖（LPS）10μg/kg腹腔注射，一次性造成大鼠ALF模型。

1.5 標本采集 造模6h后，所有大鼠10%水合氯醛3.0ml/kg腹腔注射麻醉，迅速心臟采血。采血后立即處死大鼠，沿腹中線剪開取大鼠肝左葉相同部位組織，部分用等滲冰生理鹽水沖洗后錫紙包裹放入-80℃冰箱中保存，以便制備肝組織均漿；部分用10%福爾馬林溶液固定后進行石蠟包埋、切片。

1.6 標本檢測 （1）血清生化指標及促炎因子：心臟采血2ml，離心取血清，采用全自動生化分析儀器檢測血清AST、ALT和TBIL含量；采用ELISA法檢測檢測TNF-α、IL-6、IL-10含量，操作步驟按試劑盒說明。（2）肝組織Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的檢測：肝臟組織冰上降溫，均漿器制備，離心取上清液，采用Western Blot實驗方法提取Bcl-2和Caspase-3蛋白，操作步驟按試劑盒說明。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。