實時熒光定量PCR檢測非小細胞肺癌組織中SP70及MTA1的表達及意義

梁祥森 陳 波 胡應(yīng)學 馮 震 梁運寧

（廣西醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院心胸外科，廣西 玉林 537400）

實時熒光定量PCR檢測非小細胞肺癌組織中SP70及MTA1的表達及意義

梁祥森 陳 波 胡應(yīng)學 馮 震 梁運寧

（廣西醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院心胸外科，廣西 玉林 537400）

目的探討非小細胞肺癌（NSCLC）組織中SP70抗原及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（MTA1）的表達及意義。方法采用實時熒光定量PCR相對標準曲線法檢測40例NSCLC組織和20例良性病變肺組織中SP70及MTA1的表達水平，定量分析其與臨床及病理學特征的關(guān)系，比較二者的應(yīng)用價值。結(jié)果NSCLC組SP70及MTA1平均表達水平均明顯高于肺良性病變組（1.768±0.275、1.546±0.382 vs 0.921±0.238）pmol/μL（P＜0.05），其中SP70與MTA1的表達呈正相關(guān)（r=0.458，P＜0.05），SP70平均表達水平高于MTA1（1.768 ±0.275）vs（1.546±0.382）pmol/μL（P＜0.05）；SP70及MTA1的表達水平與肺癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別、腫瘤分化程度無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論SP70及MTA1均是評價NSCLC的潛在指標，SP70可能優(yōu)于MTA1。

SP70抗原；腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（MTA1）；非小細胞肺癌

早期診治對肺癌的治療尤為關(guān)鍵，近期潘世揚等[1-2]研究發(fā)現(xiàn)一株能特異性識別NSCLC的McAbNJ00l，其所針對的靶抗原為相對分子質(zhì)量70000的胞質(zhì)新抗原SP70，SP70與NSCLC關(guān)系密切。MTA1是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，已有大量研究[3-5]證實其在NSCLC癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中意義重大。本實驗采用實時熒光定量PCR（Q-PCR）相對標準曲線法檢測40例NSCLC組織和20例良性病變肺組織中SP7O和MTA1的表達水平，定量分析其表達與NSCLC臨床與病理特征的關(guān)系，比較二者在臨床診治中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 基本資料：取我科2014年8月至2015年6月手術(shù)切除的并經(jīng)病理確診的NSCLC標本40例和20例肺良性病變組織，標本收集后立即保存于-80℃冰箱。Trizol液和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。TSYBR GreenI熒光染料：北京天根公司。引物由北京諾賽基因公司設(shè)計并合成，目的基因SP70 F：5'- CCAGTTCAAGTGCTCGG CAT-3'；R：5'-TTGCTC TTGGAACCTCGGAC-3'。MTA1 F：5'-CAGCTACGAGCA GCACAACG-3'；R：5'-TGTCCGTGGTTTGC CAGA-3'。內(nèi)參β-actin F：5'-GTGACGTTGACATC CGTAAAGACC-3'；R：5'-CTAG GAGCCAGGG CAGTAATCT -3'。熒光定量PCR儀：Step one V2.1 （美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成：按Trizol裂解抽提法提取總RNA，常規(guī)檢測其純度、濃度及完整性。將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后存放-20 ℃冰箱。

1.2.2 標準曲線的制備：通過吸附柱式瓊脂糖DNA回收法將PCR產(chǎn)物目的條帶進行回收純化，常規(guī)測定其濃度，再以10倍系列梯度進行連續(xù)倍比稀釋成106～101copies/μL數(shù)量級的標準品，實時熒光定量PCR擴增后生成標準曲線。

1.2.3 相對標準曲線法實時熒光定量PCR擴增：每份標本均擴增SP70、MTA1及β-actin，20 μL反應(yīng)體系：SYBR GreenI reaction mixture：10 μL，目的基因（10pmol/μL）上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O：17.2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預變性2 min，然后94 ℃20 s，58 ℃30 s，68 ℃45 s共40個循環(huán)，擴增完成后自動進行溶解曲線分析，每份標本重復3次，通過擴增曲線及溶解曲線判定結(jié)果是否符合實驗要求。

1.2.4 數(shù)據(jù)的標化處理：以同一樣本β-actin的模板量為參照，標化計算SP70及MTA1的相對模板數(shù)，即SP70/β-actin和MTA1/β-actin。

1.2.5 統(tǒng)計學方法：用SPSS18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，樣本均數(shù)的比較采用兩獨立樣本均數(shù)t檢驗，SP70及MTA1相關(guān)性分析用Pearson線形相關(guān)檢驗，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)果評價：目的基因SP70、MTA1及內(nèi)參β-actin的標準曲線線性關(guān)系良好，擴增效率均為R2＞0.995以上，三基因PCR擴增產(chǎn)物均在大于87.0 ℃以上獲得單一熔解峰，特異性好，經(jīng)瓊脂糖電泳確認為目的基因擴增條帶。

2.2 實驗結(jié)果：NSCLC組SP70、MTA1平均表達水平明顯高于肺良性病變組（1.768±0.275、1.546±0.382 vs 0.921±0.238）pmol/μL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中SP70與MTA1的表達呈正相關(guān)（r=0.458，P＜0.05），SP70平均表達水平高于MTA1 （1.768±0.275）vs（1.546±0.382）pmol/μL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SP70、MTA1的表達水平與肺癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別及肺癌分化程度無關(guān) （P＞0.05），見表1。

3 討 論

相關(guān)研究[1-2,6]指出SP70是一種針對NSCLC的特異性蛋白靶標，其存在于癌細胞的胞膜和胞質(zhì)，可促進癌細胞增殖，是肺癌檢測診斷的分子靶標，同時也是抗肺癌治療靶點，SP70對于NSCLC的診治意義重大。彭蘡[6]等采用ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)NSCLC患者中外周血液中SP70陽性率明顯高于對照組，提示SP70可能是診斷NSCLC的潛在血清腫瘤標志物。亦有研究[7-9]發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中SP70的檢出率明顯增高，且NSCLC患者胸腔積液中SP70檢出率高于小細胞肺癌患者，證實了SP70與NSCLC的密切關(guān)系。已有大量深入研究[3-5]證實腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MTA1與NSCLC癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。采用實時熒光定量PCR聯(lián)合檢測NSCLC組織中SP70及MTA1 mRNA表達水平的相關(guān)研究尚未見報道。本研究采用實時熒光定量PCR雙標準曲線法聯(lián)合檢測NSCLC組織中SP70及MTA1 mRNA表達水平，比較二者在臨床診治中的應(yīng)用價值，以MTA1為參照進一步探討SP70與NSCLC的關(guān)系。

實驗結(jié)果提示內(nèi)參β-actin在各檢測樣本中均陽性表達，為實驗數(shù)據(jù)的可靠性提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組SP70及MTA1平均表達水平明顯高于肺良性病變組，與既往研究[3]結(jié)論一致，證實了SP70與NSCLC的密切關(guān)系；本研究還發(fā)現(xiàn)SP70、MTA1的表達水平與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，其中SP70與MTA1的表達呈正相關(guān)，提示在NSCLC組織中SP70與MTA1的表達關(guān)系密切且為正相關(guān)，鑒于MTA1已有大量研究[3-5]證實其與NSCLC的密切關(guān)系，所以以MTA1為參照可以從側(cè)面推斷SP70與NSCLC的關(guān)系，本實驗初步證實了SP70與NSCLC臨床特征的關(guān)系，其中SP70平均表達水平高于MTA1，提示SP70具有更高的靈敏度，可能是優(yōu)于MTA1的評價NSCLC的潛在指標。此外，SP70抗原在胞質(zhì)中和胞膜上均有表達，胞質(zhì)中表達量更豐富，抗癌藥物的作用靶點更為廣泛，其潛在臨床意義重大。本實驗是基于基因水平的研究，從基因到蛋白的過程可能會發(fā)生一些逆轉(zhuǎn)性變化，而且本研究樣本量較少，隨訪時間短，本研究的結(jié)論需進一步證實，有待于加大樣本量，加強隨訪，同時監(jiān)測SP70在外周血液中的表達情況，從蛋白水平進一步研究，可能會發(fā)現(xiàn)SP70與NSCLC的作用機制以及預后的關(guān)系。

表1 SP70及MTA1的表達與NSCLC臨床特征的關(guān)系（±s）

表1 SP70及MTA1的表達與NSCLC臨床特征的關(guān)系（±s）

病理學參數(shù)例(n)SP70 mRNAt值P值MTA1 mRNAt值P值男242.06±0.371.6080.1151.55±0.271.2080.144女161.47±0.441.43±0.36＜60歲181.64±0.12-0.9810.3351.62±0.23-0.650.521≥60歲221.88±0.431.82±0.19有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移181.99±0.34-1.9770.0241.89±0.47-2.650.016無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移221.02±0.210.92±0.59高分化291.49±0.29-1.4120.1481.41±0.260.0720.943低分化112.11±0.291.76±0.37Ⅰ+Ⅱ期211.42±0.15-2.2290.0141.03±0.34-0.1180.027Ⅲ+Ⅳ期192.19±0.441.95±0.45

[1] Shiyang P,Fang W,Peijun H,et al.The study on newly developed McAb NJ001 specific to non-small cell lung cancer and its biological characteristics[J].PLo S One,2012,7(3):e33009.

[2] 徐婷,潘世揚,王芳.抗人非小細胞肺癌單克隆抗體的制備及鑒定[J].臨床檢驗雜志,2011,31(3):216-218.

[3] Li D,Qian J,Hong Z.Expression and clinical significance of MTA1 in non-small cell lung cancer [J].Zhongguo Fei Ai Za Zhi,2008,11 (6):775-779.

[4] 劉晨旭,周斌.MTAl蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J].醫(yī)學信息,2010,23(4):922-924.

[5] 陳銘伍,梁祥森,冼磊.非小細胞肺癌中MTA1基因的表達及意義[J].江蘇醫(yī)藥,2012,38(15):1761-1763.

[6] 彭蘡,潘世揚,王芳,等.非小細胞肺癌患者血清中SP70的檢測及其臨床意義[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2012,35(6):554-558.

[7] 鄧石雄,劉映云,李爾凡,等.SP70檢測在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價值[J].中國實驗診斷學,2014,18(5):746-748.

[8] 張丹華.SP70抗原在癌性胸腔積液鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價值[J].醫(yī)學綜述,2015,21(10):1865-1866.

[9] 楊瑞霞,潘世揚,王芳,等.良惡性胸腔積液鑒別中SP70檢測的臨床意義[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2012,35(12):1150-1154.

R734.2

B

1671-8194（2017）15-0028-02

廣西醫(yī)科大學青年科學基金資助項目 (GXMUYSF 201339)