氯化汞對大鼠血管內皮損傷的毒性研究

姚凱，樊雙義，孫彬彬，楊帆

(軍事醫學科學院附屬醫院神經內科，北京100071)

氯化汞對大鼠血管內皮損傷的毒性研究

姚凱，樊雙義，孫彬彬，楊帆

(軍事醫學科學院附屬醫院神經內科，北京100071)

目的研究不同劑量氯化汞對SD大鼠的血管內皮損傷情況。方法將54只雄性SD大鼠簡單隨機分為四組，高、中、低氯化汞中毒組，每組15只，對照組9只；采用高(17 mg·kg-1·d-1)、中(8.5 mg·kg-1·d-1)、低劑量(4.25 mg·kg-1·d-1)濃度氯化汞鹽水溶液灌胃建立SD大鼠亞急性汞中毒動物模型。中毒后7 d、14 d、21 d分別測定大鼠血細胞汞值、血清一氧化氮(NO)和內皮素-1(ET-1)值，同時行循環內皮細胞(CEC)計數。結果對照組血細胞汞值接近于零，中毒組與對照組差異均有統計學意義(P＜0.05)。血清ET-1組間比較，高劑量組與對照組差異有統計學意義(P＜0.05)；組內比較，不同時期ET-1值差異有統計學意義（P＜0.05）。血清NO組間比較，各劑量組與對照組差異均有統計學意義(P＜0.05)；同期比較，不同中毒劑量組之間比較差異也有統計學意義(P＜0.05)；組內比較，不同時期之間差異均有統計學意義(P＜0.05)。血循環內皮細胞計數組間比較，各劑量組與對照組差異均有統計學意義(P＜0.05)；組內比較，不同時期之間差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論氯化汞可對血管內皮細胞有直接損傷作用，且損傷作用與劑量、時間存在同一變化趨勢。

氯化汞；中毒；血管內皮損傷；一氧化氮；內皮素-1；循環內皮細胞

現代工農業生產，國防、醫藥和科研部門中，汞的應用極廣，汞及其衍生物有機汞，因具有持久性、易遷移性、高度的生物富集性和高生物毒性等特點，對人類健康和生態環境構成很大危害。因此，防治職業性汞中毒和防止汞對環境的污染都具有重要意義。既往研究表明汞中毒的主要靶器官主要是神經系統，其次是消化系統和腎，最新資料表明汞對心腦血管同樣有損傷作用[1]。2000年芬蘭學者的一項前瞻性人類研究發現，汞可能是心血管疾病增加的一個重要獨立危險因素[2]。近年來，越來越多的研究揭示汞中毒與高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病、腦血管病有密切關系[3-5]。既往認為汞對心腦血管疾病的損傷是通過損傷中樞神經系統后引起的繼發改變[5-6]，但最新研究推測汞可能對血管內皮具有直接損傷作用[7]。目前上述問題在國外研究資料較少[8-9]，國內尚無相關研究。本試驗擬通過建立氯化汞灌胃的SD大鼠亞急性汞中毒動物模型[10]，研究氯化汞中毒后大鼠不同時期不同劑量下血管內皮損傷情況，并探討其可能的損傷機制，為汞與心腦血管疾病相關性研究提供證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠54只，4周齡，體重160～220 g，活動能力相近，購自軍事醫學科學院動物實驗中心；實驗動物質量許可證號：023765；軍事醫學科學院豐臺動物實驗中心毒物實驗動物房飼養，SPF級，自由飲水，光照白天11 h，夜間13 h，溫度25℃。

1.2 試劑與儀器毒劑氯化汞(購自軍事醫學科學院危險品庫)，制成濃度為1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL氯化汞生理鹽水的灌胃制劑。一氧化氮(NO)和內皮素-1(ET-1)檢測試劑盒購自武漢華美試劑有限公司，美國產酶標儀型號Multiskan-FC測定OD值；美國產Agilent氣相色譜儀型號ICP-MS7700測定血細胞汞值；用離心機進行血清、細胞離心分離工作；日本產奧林巴斯PM-6光學顯微鏡觀察計數。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與染毒SD雄性大鼠采用簡單隨機法按實驗設計分為四組，高、中、低氯化汞中毒組每組15只，對照組9只；高劑量組(17 mg·kg-1·d-1)、中劑量組(8.5 mg·kg-1·d-1)、低劑量組(4.25 mg·kg-1·d-1)經口灌胃氯化汞鹽水溶液；對照組生理鹽水(2 mL/d)經口灌胃；四組均連續灌胃21 d，每次取血期間均留取少量樣本送檢血細胞汞含量，判斷是否造模成功[10]。

1.3.2 判斷造模成功的標準(1)實驗室檢查標準：動物血細胞汞含量檢查高于正常指標；(2)臨床癥狀標準：動物出現步態不穩、痙攣、行動障礙等神經系統受損癥狀或下肢水腫等腎損傷表現。

1.3.3 檢測指標各組SD大鼠在第7天、第14天、第21天，分別觀察大鼠一般活動情況、測定紅細胞汞值、血清ET-1和NO值，對血循環內皮細胞計數[11-12]。血細胞汞含量采用冷原子吸收光譜測定法，具體步驟：制備Hg元素標準曲線濃度：0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL；精密稱定大鼠血細胞，加入1 mL濃硝酸，蓋緊蓋，放入100℃水浴中消解2 h，待溶液透明時，開蓋，散氣40 min，用超純水定容至10 mL后，混勻待測。使用ICP-MS進行測定，具體工作參數如下：射頻功率1 550 W，同心霧化氣MicroMist，采樣深度8 mm，載氣流速0.70 L/min，補償氣流速0.40 L/min，He氣流速3.3 mL/min，等離子氣流15 L/min，重復3次，采集模式No gas/He模式，測定得到紅細胞內的具體汞值，根據已經測量的紅細胞重量，按公式紅細胞汞值=紅細胞汞含量(μg)/紅細胞重量(g)進行換算。血清NO(或 ET-1)測定采用應用雙抗體夾心法，具體步驟按照實際說明書操作。血循環內皮細胞計數[13-14]采用Percoll密度梯度快速一步離心法，該法是應用密度梯度分層離心的原理，將適當的密度梯度分層液加入抗凝血中，利用血液中各種細胞的不同比重進行離心分層，然后鏡檢，取上、中層內皮細胞平均數為CEC值。

1.3.4 動物處死及標本采集SD大鼠在第7天、第14天、第21天進行取樣，染毒組每次取5只，對照組每次取3只，予以25%烏拉坦(0.25 g/kg)麻醉后使用解剖器械暴露心臟，于心臟右心室中采血6 mL，其中3 mL用于血循環內皮細胞計數，2 mL分離血清后測定NO和ET-1，1 mL檢測血細胞汞含量。

1.4 統計學方法將數據輸入Excel表格，采用SPSS17.0數據分析軟件包分析數據；計量數據采用均數±標準差(±s)表示；兩組間比較采用兩獨立樣本秩和檢驗(Mann-Whitney U檢驗)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況高劑量中毒組中毒后7 d開始出現精神萎靡，活動減少等表現，隨機抽取5只處死取樣；14 d發現有4只大鼠出現步態不穩、下肢拖行癥狀，有5只大鼠出現下肢水腫，死亡4只，剩余6只全部處死取樣；21 d高劑量大鼠均未存活，數據缺失。中劑量組7 d時發現有少部分大鼠精神變差、活動減少，進食減少，死亡1只，故隨機抽取4只處死取樣；14 d時有3只出現下肢拖行情況，僅有2只出現下肢水腫，隨機抽取5只處死取樣；21 d時大鼠精神萎靡、活動減少、毛發粗糙，3只存在下肢拖行和水腫，剩余5只處死取樣；低劑量組7 d時大鼠行為未見明顯異常，死亡1只，隨機抽取4只處死取樣；14 d時有3只大鼠出現精神變差，活動進食減少，未見下肢水腫和活動障礙，隨機抽取5只處死取樣；21 d時有1只出現下肢輕度水腫，未見活動障礙，死亡1只，隨機抽取4只處死取樣；對照組無異常，7 d、14 d、21 d分別處死3只取樣，見表1。

表1 不同劑量中毒后SD大鼠出現的中毒癥狀統計[只（%）]

2.2 各組不同時期的血細胞汞值比較對照組血細胞汞值接近于零，14 d高劑量組血細胞汞值與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.010)，21 d中劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.029)；21 d低劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.016)，見表2，實驗結果與實際情況保持一致，證實中毒模型較為成功。

表2 不同劑量中毒后SD大鼠不同時期血細胞汞值（μg/g）

2.3 各組血清NO和ET-1水平比較中毒后大鼠血清內ET-1與對照組比較多數差異無統計學意義，僅中毒14 d后，ET-1的高劑量組和對照組差異有統計學意義(U=0.000，P=0.010)，組內比較高劑量中毒組SD大鼠7 d和14 d的血清ET-1出現明顯降低(U= 0.000，P=0.004)，中、低劑量組血清ET-1差異無統計學意義(P＞0.05)，但可以看到整體呈下降趨勢，見表3。大鼠的血清NO14 d高劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.010)，21 d中劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.016)，21 d低劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P= 0.016)。組間比較：高劑量組7 d與14 d比較差異有統計學意義(U=1.000，P=0.009)；中劑量組14 d與21 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.008)；中劑量組7 d與21 d比較差異有統計學意義(U=1.000，P=0.032)；低劑量組7 d與14 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.016)，低劑量組7 d與21 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.016)。7 d時高劑量組與低劑量組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.016)，且存在與中毒劑量相關的一致性明顯下降趨勢，見表4。

表3 不同劑量中毒后SD大鼠不同時期血清ET-1值(μmol/L)

表4 不同劑量中毒后SD大鼠不同時期血清NO值(ng/L)

2.4 各組的血循環內皮細胞計數比較血循環內皮細胞計數增多是反映血管內皮損傷的直接特異指標，中毒后SD大鼠在14 d時的血循環內皮細胞數目高劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U= 0.000，P=0.024)，中劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.036)，低劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=4.000，P=0.393)；21 d時的血循環內皮細胞數目中劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.036)，低劑量組與對照組比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.036)。高劑量組CEC計數7 d與14 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P= 0.004)；中劑量組7 d與14 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.036)，14 d與21 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.008)，7 d與21 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.036)；低劑量組7 d與14 d比較差異有統計學意義(U=6.500，P=0.413)，14 d與21 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.008)，7 d與21 d比較差異有統計學意義(U=0.000，P=0.016)，見表5。

表5 不同劑量中毒后SD大鼠不同時期血CEC計數(cells/μL)

3 討論

汞可對多器官造成損傷，除傳統研究認為的神經、消化系統和腎臟外，最新研究表明心腦血管也是一個重要靶系統[15-16]。目前多項人口統計學研究資料均提示汞是心血管疾病增加的一個重要危險因素[2，17]，但汞對心腦血管系統損傷的機制尚未研究清楚。早先觀點認為神經系統功能完備與心血管功能正常發揮作用密切相關，汞中毒后會對中樞和周圍神經造成損傷，神經系統功能受損后會繼發引起心腦血管的損傷。2010年de Marco等[18]發現含汞環境下血管內皮細胞產生的NO含量減少，提示汞中毒可能對血管內皮有直接損傷，但其結論是基于單細胞狀態的體外細胞培養實驗。眾所周知，受內環境的影響，體外培養的內皮細胞從形態到功能都與活體內的血管內皮細胞有所差異，尚不能完全說明全部問題。目前仍缺乏從動物活體狀態去觀察血管內皮細胞的損害以及對機體產生的繼發影響的研究，現有結果更是無法解答這些損害有哪些的是急性的，發生了什么慢性變化，以及在低劑量汞暴露下的慢性損傷。這些問題都需要進行科學研究才能得到回答。本研究擬在建立汞中毒大鼠動物模型后，通過研究不同時期不同中毒劑量下血管內皮細胞分泌的相關功能分子NO和ET-1含量變化，以及CEC計數變化和腹主動脈內膜厚度變化，證實汞對血管內皮有直接損傷作用，研究汞中毒對血管的損傷程度，為汞與心腦血管疾病相關性研究提供證據。

本研究中，低劑量汞中毒大鼠紅細胞汞值與中、高劑量組不同，在早期表現更為明顯，考慮可能與低濃度汞更容易通過大鼠消化道吸收有關。數據結果顯示高、中、低各組大鼠灌胃后的血細胞汞值各組之間差異并無統計學意義，且同組內中毒早中晚階段差異也無統計學意義，分析可能的原因與汞的吸收代謝過程有關，汞在早期是隨血液均勻分布的，但后期主要富集于腎臟和神經組織，血液中的汞濃度確實有可能低于早期，血細胞汞值的高低與SD大鼠中毒程度的輕重無關。這與臨床中不把血汞值的高低作為中毒輕重的標準，而是通過臨床癥狀進行分級的情況一致。

血管內皮細胞分泌的NO和ET-1是非常重要的調節血管功能的活性因子。本研究結果顯示汞中毒后的SD大鼠的血清NO和ET-1水平與對照組有明顯差異，且CEC計數較對照組明顯增加，均證實汞中毒后SD大鼠血管內皮受到直接損傷。組內不同時期結果比較證實隨著中毒時間的延長，SD大鼠血管內皮細胞產生的NO和ET-1呈降低趨勢；中毒同期組間比較結果中，中毒7 d后SD大鼠的高劑量組與低劑量組血清NO差異有統計學意義，提示不同劑量的汞對血管內皮損傷程度也不同。CEC增多是特異性的活體血管內皮受損指標，本研究中血CEC計數隨SD大鼠汞中毒時間延長而增加，說明汞中毒后的血管內皮細胞損害持續并逐漸加重。根據實驗結果說明汞對血管內皮有直接損傷，且損傷的程度與時間和劑量存在同一變化趨勢。

汞中毒影響了SD大鼠血管內皮細胞的分泌功能，導致其分泌的功能因子NO和ET-1減少，出現血清NO和ET-1水平均下降，尤以對NO的合成影響更加明顯。結合既往研究結論汞作為二價金屬離子可干擾細胞內多種金屬酶的活性[13]，推測汞損傷血管內皮的具體機制可能是因為汞干擾了血管內皮細胞的NO和ET-1合成過程中相關酶活性所致，實驗結果中出現的NO表現出較為明顯的抑制作用，提示汞離子可能對NO合成途徑中的某個酶的酶活性抑制較為敏感。但汞損傷血管內皮的分子生物學機制仍需進一步深入研究。本研究只能證實在SD大鼠在亞急性汞中毒期間其血管內皮細胞存在直接損傷，但這種損害是否會導致心血管疾病的發生，本實驗未能得出相關結論。同時本研究只是初步證實了在汞中毒的活體SD大鼠體內的血管內皮受到直接損傷，但血管損傷的病理變化、嚴重程度及對心臟和血管舒縮功能變化的影響等都未做相關研究，筆者希望在后續的實驗中進一步論證。

[1]Stern AH.A review of the studies of the cardiovascular health effects of methylmercury with consideration of their suitability for risk assessment[J].Environ Res,2005,98(1):133-142.

[2]Rissanen T,Voutilainen S,Nyyss Nen K,et al.Fish oil-derived fatty acids,docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid,and the risk of acute coronary events:the Kuopio ischaemic heart disease risk factor study[J].Circulation,2000,102(22):2677-2679.

[3]Moreira EL,de Oliveira J,Dutra MF,et al.Does methylmercury-induced hypercholesterolemia play a causal role in its neurotoxicity and cardiovascular disease?[J].Toxicol Sci,2012,130(2):373-382.

[4]Salonen JT,Sepp Nen K,Lakka TA,et al.Mercury accumulation and accelerated progression of carotid atherosclerosis:a population-based prospective 4-year follow-up study in men in eastern Finland[J]. Atherosclerosis,2000,148(2):265-273.

[5]Choi AL,Weihe P,Budtz-J?rgensen E,et al.Methylmercury exposure and adverse cardiovascular effects in faroese whaling men[J]. Environ Health Perspect,2009,117(3):367-372.

[6]Grandjean P,Murata K,Budtz-J?rgensen E,et al.Cardiac autonomic activity in methylmercury neurotoxicity:14-year follow-up of a Faroese birth cohort[J].J Pediatr,2004,144(2):169-176.

[7]Wiggers GA,Pecanha FM,Briones AM,et al.Low mercury concentrations cause oxidative stress and endothelial dysfunction in conductance and resistance arteries[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008,295(3):H1033-H1043.

[8]Wiggers GA,Furieri LB,BrionesAM,et al.Cerebrovascular endothelial dysfunction induced by mercury exposure at low concentrations [J].Neurotoxicology,2016,53:282-289.

[9]Omanwar S,Fahim M.Mercury exposure and endothelial dysfunction:an interplay between nitric oxide and oxidative stress[J].Int J Toxicol,2015,34(4):300-307.

[10]周永田,徐旭東,杜景云,等.汞對大鼠周圍神經影響的形態學研究[J].職業衛生與應急救援,2007,25(1):10-13.

[11]Boos CJ,Lip GY,Blann AD.Circulating endothelial cells in cardiovascular disease[J].JAm Coll Cardiol,2006,48(8):1538-1547.

[12]Erdbruegger U,Haubitz M,Woywodt A.Circulating endothelial cells:a novel marker of endothelial damage[J].Clin Chim Acta, 2006,373(1-2):17-26.

[13]楊映波,王正國,朱佩芳,等.一種分離循環內皮細胞的新方法[J].中國藥理學與毒理學雜志,1994,8(1):29.

[14]隆淑芬,劉淵,蘇先華.循環血內皮細胞分離技術[J].中國民康醫學(上半月),2007,19(19):872.

[15]Rizzetti DA,Torres JG,Escobar AG,et al.Apocynin prevents vascular effects caused by chronic exposure to low concentrations of mercury[J].PLoS One,2013,8(2):e55806.

[16]Mozaffarian D,Shi P,Morris JS,et al.Mercury exposure and risk of cardiovascular disease in two U.S.Cohorts[J].N Engl J Med,2011, 364(12):1116-1125.

[17]Valera B,Dewailly é,Poirier P.Association between methylmercury and cardiovascular risk factors in a native population of Quebec(Canada):a retrospective evaluation[J].Environ Res,2013,120:102-108. [18]de Marco KC,Passos CJ,Sertorio J,et al.Environmental exposure to methylmercury is associated with a decrease in nitric oxide production[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2010,106(5):411-415.

Toxic injury study of mercuric chloride on vascular endothelial cells in rats.

YAO Kai,FAN Shuang-yi,SUN Bin-bin,YANG Fan.
Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,CHINA

ObjectiveTo study the injury of SD rats'vascular endothelial cell poisoned with different doses of mercuric chloride(HgCl2).MethodsThe SD rat animal models were created by gavaging different doses of HgCl2.A total of 54 male rats were randomized into 4 groups:high,medium,low dose HgCl2group(n=15 in each,poisoned with 17 mg·kg-1·d-1,8.5 mg·kg-1·d-1,4.25 mg·kg-1·d-1HgCl2,respectively),and control group(n=9).The levels of Hg in blood cell,NO and endothelin-1(ET-1)in serum were measured on the 7thday,14thday and 21thday,and the number of circulating endothelial cells(CEC)was counted at the same time.ResultsLevel of Hg:The levels of Hg in control group were close to zero,and there were statistically significant differences between high,medium,low dose HgCl2groups and control group.Levels of serum ET-1:Between-group comparison showed significant differences between high dose HgCl2group and control group,and within-group comparison revealed significant differences during different time.Levels of serum NO:Between-group comparison showed that there were significant differences between high,medium,low dose HgCl2groups and control group,and also among the high,medium,low dose HgCl2groups at the same time,and within-group comparison revealed showed that there are significant differences during different time.CEC counts:Between-group comparison showed significant differences between high,medium,low dose HgCl2groups and control group,and within-group comparison revealed significant differences during different time.ConclusionHgCl2can cause direct injury and dysfunction to vascular endothelial cells,and its injury has the same changing trend with dose and time.

Mercuric chloride;Poisoning;Vascular endothelial injury;NO;Endothelin-1(ET-1);Circulating endothelial cells(CEC)

R-332

A

1003—6350（2017）12—1897—04

2017-01-02)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.12.002

國家科技支撐計劃課題（編號：2012BAI38B01）

樊雙義。E-mail：fanshy309@sina.com