PPARγ激動劑羅格列酮對大鼠腎臟再灌注損傷的保護作用

羅京

(巴中市中心醫院兒科，四川巴中610000)

PPARγ激動劑羅格列酮對大鼠腎臟再灌注損傷的保護作用

羅京

(巴中市中心醫院兒科，四川巴中610000)

目的探討羅格列酮(Rosiglitazone,RGZ)對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用及作用機制。方法將30只大鼠按照雙盲法隨機均分成假手術組(Sham)、缺血性腎損傷組(IRI)和羅格列酮(RGZ)組，各10只。利用血管夾夾閉左側腎蒂，去除右腎誘導大鼠腎缺血再灌注損傷模型，缺血45 min，再灌注4 h。ELISA檢測血清血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-8(IL-8)和白介素-6(IL-6)表達水平；RT-PCR檢測TNF-α、IL-8和IL-6 mRNA水平；硫代巴比妥酸(TBA)法檢測丙二醛(MDA)的含量；Western blot檢測PPAR-γ和p-PPAR-γ表達水平；黃嘌呤氧化酶法檢測過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)活性；過碘酸雪夫氏(PAS)染色檢測腎組織病理形態。結果IRI組血清Cr和BUN分別為(160.15±25.17)μmol/L和(90.22±16.17)mmol/L，較RGZ組的(47.16±5.13)μmol/L和(23.11±3.28)mmol/L明顯增高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；IRI組腎臟病理損傷評分為(3±0.5)分，較RGZ組的(1±0.5)分明顯增高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；IRI組血清中TNF-α、IL-8和IL-6表達水平分別為(1 400±350)pg/mL、(1 200±300)pg/mL、(1 150±250)pg/mL，較RGZ組的(650±150)pg/mL、(450±120)pg/mL和(550±170)pg/mL明顯增高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；IRI組腎臟中TNF-α、IL-8和IL-6 mRNA表達水平分別為(14.00±55)、(11.00±4.3)、(9.50±2.8)，較RGZ組的(5.50±1.7)、(6.40±2.1)和(3.80±1.3)明顯增高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；IRI組腎臟中MDA含量為(18.12±4.15)nmol/mg，較RGZ組[(7.12±1.15)nmol/mg明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；IRI組腎臟中CAT、GPX和SOD活性分別為(8.77± 1.52)U/mg、(7.22±1.03)U/mg和(6.54±1.22)U/mg，較RGZ組的(25.17±3.22)U/mg、(23.42±3.07)U/mg和(21.22± 2.79)U/mg明顯增高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；IRI組腎臟中p-PPAR-γ含量為(0.32±0.07)，較RGZ組的(0.51±0.11)明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)；IRI組與RGZ組P PAR-γ表達差異無統計學意義(P＞0.05)。結論PPAR-γ激動劑羅格列酮對大鼠腎缺血再灌注損傷具有保護作用，能夠減少腎臟病理改變，其作用機制與抑制氧化應激和炎癥反應相關。

羅格列酮；腎缺血再灌注損傷；炎癥；氧化應激

缺血再灌注損傷是指缺血器官或組織恢復中斷的氧供應或血流灌注后，對器官或者組織所產生的損傷反而進一步加重的臨床危像[1-2]。腎臟作為血流高灌注的器官之一，對血供中斷或減少以及再灌注損傷尤其敏感[1-2]，隨著冠脈造影技術、心臟體外大循環以及腎臟移植手術的廣泛開展，腎臟缺血-再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)在臨床上越來越常見[4-6]。過氧化物酶增殖酶受體激動劑羅格列酮(RGZ)是臨床上用于治療糖尿病的的噻唑烷二酮類藥物，研究發現其除具有降糖作用外，還具有降血脂，清除活性和抑制炎癥的作用，并對器官缺血損傷有保護作用[7-8]。因此本研究擬探討RGZ對IRI的保護用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器羅格列酮(Sigma,USA)、水合氯醛(谷歌生物)。PPAR-γ(CST、USA)、p-PPAR-γ (CST,USA)、β-actin(CST，USA)、逆轉錄試劑盒(Gene-Copoeia，USA)、TRIzol reagent(Invitrogen，USA)，PAS試劑由四川省人民醫院病理實驗室配制。顯微鏡及成像系統均由南充市中心醫院病理實驗室提供，紫外分光光度計(Thermo Fisher)、RT-PCR儀(BIO-RAD IQ5)、逆轉錄儀(Eppendorf)。

1.2 實驗動物健康雄性SD大鼠30只(北京市華福康實驗動物中心提供)，SPF級，6～8周，體質量220～250 g，合格證號SCXK(京)2009-0005，每籠5只，飼養于標準環境，12 h光照周期。適應性喂養1周。

1.3 實驗分組30只雄性SD大鼠雙盲法隨機分為假手術組(Sham)，腎臟缺血再灌注損傷組(IRI)和羅格列酮(RGZ)劑量組。RGZ組術前45 min給予RGZ (40 mg/kg)腹腔注射。Sham和IRI組則給予等量生理鹽水腹腔注射；IRI組和RGZ組施行IRI手術，Sham組操作同上，但不夾閉左側腎蒂。具體IRI手術方式參考文獻[9]。

1.4 腎臟病理檢查取各組腎組織標本，甲醛固定、浸蠟、包埋，用石蠟切片機切割成4 μm切片，用過碘酸雪夫氏染色(Schiff periodic acid shiff，PAS)染色，利用光鏡觀察腎臟病理形態，并請病理醫生評分。分級評分標準：0分=正常；1分=＜10%；2分=10%～25%；3分=26%～75%，4分=＞75%，具體評分標準參考文獻[9]。

1.5 ELISA檢測按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白細胞介素-6(L-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-8(IL-8)表達水平。

1.6 檢測腎組織丙二醛(MDA)的含量和過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)活性硫代巴比妥酸法檢測腎臟MDA的含量；黃嘌呤氧化酶法檢測腎CAT、GPx和SOD活性，具體步驟操作參見說明書。

1.7 Western blot檢測各組蛋白表達按說明書方法提取各組腎組織總蛋白，定量，變性，上樣，電泳，轉膜，封閉，孵一抗PPAR-γ(1:1000)、p-PPARγ(1:500)和β-actin(1:4 000)，洗膜，孵二抗IgG(1：400)，洗膜，顯影，分析，具體方法參考說明書

1.8 RT-PCR檢測各組mRNA水平取腎臟組織，研磨，提取總RNA，檢測RNA含量，反轉錄，上樣檢測。PCR以β-actin為內參，具體方法參考文獻[6]，引物序列如表1所示。擴增條件為：95℃(10 min)→95℃(10 s)→60℃(1min)×40個循環，利用圖像分析儀器上進行掃描分析，將IL-6、TNF-α和IL-8基因擴增產物的密度與β-actin基因擴增產物的密度之比作為mRNA表達水平，基因的具體引物序列參見表1。

表1 基因引物序列

1.9 統計學方法數據采用SPSS12.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用One-way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 羅格列酮可降低血清中Cr和BUN的表達水平Sham組和RGZ血清Cr和BUN均較IRI組明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 RGZ預處理對血清Cr和BUN的表達影響(±s)

表2 RGZ預處理對血清Cr和BUN的表達影響(±s)

注：Sham組與IRI組比較，aP＜0.001；RGZ組與IRI組比較，bP＜0.05。

組別Sham組IRI組RGZ組BUN(mmo/L) 8.22±2.45 90.22±16.17a23.11±3.28b只數10 10 10 Cr(μmol/L) 15.27±3.15 160.15±25.17a47.16±5.13b

2.2 羅格列酮可減輕腎組織病理結構改變PAS染色結構顯示，Sham腎小球和腎小管結構清楚，病理結構無異常改變，其損傷評分為(0.2±0.1)分；IRI組腎小球、腎間質明顯充血，局部甚至有出血，腎小管結構排列紊亂，間質疏松，管腔擴張，小管上皮細胞明顯腫脹，其損傷評分為(3±0.5)分；RGZ組腎小球、腎間質輕度充血，腎小管輪廓清楚結構，小管上皮細胞輕度腫脹，其損傷評分為(1±0.5)分，見圖1。

2.3.羅格列酮可降低血清中促炎癥細胞因子TNF-α、IL-8和IL-6的表達水平ELISA檢測結果顯示，與Sham組比較，IRI組血清中TNF-α，IL-6和IL-8表達明顯上調，差異均有統計學意義(P＜0.05)；與IRI組比較，RGZ組血清中TNF-α，IL-6和IL-8表達水平明顯下調(P＜0.05)，差異均有統計學意義；提示羅格列酮可減輕血清中促炎癥細胞因子TNF-α，IL-8和IL-6的表達水平，見表3。

2.4 羅格列酮可降低腎臟促炎癥細胞因子TNF-α，IL-8和IL-6 mRNA表達水平RT-PCR檢測結果顯示與Sham組比較，IRI組腎臟中TNF-α，IL-6和IL-8 mRNA表達水平均明顯增高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；與IRI組比較，RGZ組腎臟中TNF-α，IL-6和IL-8 mRNA表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)；與IRI組比較，RGZ組腎臟中TNF-α，(P＜0.05)，見表4。

2.5 羅格列酮可降低腎組織MDA的含量TBA檢測結果顯示：Sham組及RGZ組腎組織MDA含量均較IRI組腎組織MDA含量明顯降低，兩者比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表5。

2.6 羅格列酮可增加腎組織CAT、GPx和SOD的活性黃嘌呤氧化酶法檢測結果顯示：Sham組及RGZ組腎組織CAT、GPX和SOD活性均較IRI組明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表6。

2.7 羅格列酮可以促進PPAR-γ的激活Western blot檢測結果顯示：IRI組p-PPAR-γ含量較Sham組明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；RGZ組腎組織中p-PPAR-γ含量較IRI組進一步增高，差異亦有統計學意義(P＜0.05)；三組之間PPAR-γ表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2和表7。

圖1 RGZ對腎組織病理結構的影響

表3 羅格列酮對血清中促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8表達水平的影響(±s)

表3 羅格列酮對血清中促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8表達水平的影響(±s)

注：Sham組與IRI組比較，aP＜0.01；RGZ組與IRI組比較，bP＜0.05。

組別只數TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-1β(pg/mL) Sham組IRI組RGZ組10 10 10 110±15 1 400±350a650±150b105±10 1 200±300a450±120b100±10 1 150±250c550±170b

表4 羅格列酮對腎臟促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達水平的影響(±s)

表4 羅格列酮對腎臟促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達水平的影響(±s)

注：Sham組與IRI組比較，aP＜0.01；RGZ組與IRI組比較，bP＜0.05。

組別Sham組IRI組RGZ組IL-6 mRNA 1.00±0.05 11.00±4.3a6.40±2.1b只數10 10 10 TNF-α mRNA 0.95±0.05 14.00±5.5a5.50±1.7bIL-1β mRNA 1.05±0.05 9.50±2.8a3.80±1.3b

表5 羅格列酮對MDA含量的影響(±s)

表5 羅格列酮對MDA含量的影響(±s)

注：Sham組與IRI組比較，aP＜0.01；RGZ組與IRI組比較，bP＜0.05。

組別Sham組IRI組RGZ組只數10 10 10 MDA(nmol/mg) 1.02±0.15 18.12±4.15a7.12±1.15b

表6 羅格列酮對腎組織CAT,GPx和SOD活性的影響(±s)

表6 羅格列酮對腎組織CAT,GPx和SOD活性的影響(±s)

注：Sham組與IRI組比較，aP＜0.01；RGZ組與IRI組比較，bP＜0.05。

組別SOD(U/mg)只數CAT(U/mg)GPX(U/mg) Sham組IRI組RGZ組31.18±3.09 6.54±1.22a21.22±2.79b10 10 10 41.22±5.12 8.77±1.52a25.17±3.22b35.26±4.13 7.22±1.03a23.42±3.07b

圖2 Western blot檢測RGZ預處理對PPAR-γ和p-PPAR-γ表達水平影響

表7 羅格列酮對腎組織PPAR-γ和p-PPAR-γ表達的影響(±s)

表7 羅格列酮對腎組織PPAR-γ和p-PPAR-γ表達的影響(±s)

注：Sham組與IRI組比較，aP＜0.01；RGZ組與IRI組比較，bP＜0.05。

組別Sham組IRI組RGZ組只數10 10 10 p-PPAR-γ/β-actin 0.12±0.03 0.32±0.07a0.51±0.11bPPAR-γ/β-actin 0.42±0.11 0.47±0.13 0.45±0.12

3 討論

缺血性腎血管病是好發于臨床的危重疾病，其發病率高且預后不佳，目前已經嚴重威脅到人類的身心健康。及時解除血管壓迫或開放血流再灌注是臨床上常用的減輕腎臟缺血腎損傷的治療手段，但容易引發“腎缺血再灌注損傷[10-11]。缺血再灌注損傷涉及異常復雜的病理生理機制，其中炎癥引發的炎癥反應和自由基過多引發的氧化應激反應在其中扮演重要作用[4-6]。

腎臟是對缺血缺氧極度敏感的器官之一，腎臟血流灌注被阻斷后腎組織將迅速出現氧耗竭，導致無氧酵解出現，引發乳酸蓄積和酸中毒，導致肌酐，尿素氮外滲，引起血清中兩者表達水平迅速驟然增高，故可作為腎臟細胞損傷的特異性檢測指標[10-11]。血清和腎組織中TNF-α、IL-8和IL-6表達水平能夠腎臟炎癥反應的強弱。此外脂質氧化應激反應的終末產物MDA含量的高低可反映機體氧化應激的強弱，也可間接反映體內活性氧自由基的表達水平；既往研究就顯示，SOD可通過清除氧自由基而阻斷自由基介導的脂質過氧化級聯反應，其作用機制為氧自由基結合生成過氧化氫；而過氧化氫可被CAT和GPx催化生成水，繼而可進一步降低氧化應激損傷；所有SOD、CAT和GPx活性的高低可反映機體清除體內活性氧自由基的強弱以及抗氧化應激損傷的能力。

羅格列酮是臨床上常用的降糖藥，是PPAR-γ的激動劑之一，既往研究顯示其除具有降糖功效外，還具有調節免疫和抑制炎癥等活性[7-8]。本研究通過大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型研究發現，羅格列酮可有效減少腎臟缺血病變，減少腎組織病理形態改變，降低Cr、BUN、IL-8、TNF-α、IL-6和MDA的表達，同時增加CAT、GPx、SOD和PPAR-γ活性。

綜上所述，羅格列酮對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用，該作用機制可能與羅格列酮可激活PPAR-γ有效改善抗氧化酶和抗炎系統活性，降低炎癥反應和自由基損傷相關。

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Protective effect of PPAR-γagonist rosiglitazone on renal ischemia-reperfusion injury.

LUO Jing.Department of Pediatrics,the Central Hospital of Bazhong City,Bazhong 610000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo explore the protective effect and potential mechanism of rosiglitazone(RGZ)on renal ischemia reperfusion injury.MethodsThirty male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly equally divided into 3 groups:Sham group,ischemia-reperfusion injury(IRI)group,and RGZ group.The left renal pedicle was clamped with vascular clamp,and the model of renal ischemia-reperfusion injury was induced by removing right kidney with 45 minutes of ischemia and 4 hours of reperfusion.The expression of creatinine(Cr),blood urea nitrogen(BUN),tumor necrosis factor alpha(TNF-α),interleukin-6(IL-6),and interleukin-8(IL-8)in the serum were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The mRNA level IL-8,TNF-α,and IL-6 in the kidney were evaluated by RT-PCR.The content of malondialdehyde(MDA)was by measured by thiobarbituric acid(TBA)method.The expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPAR-γ)and p-PPAR-γ were evaluated by Western blot.The activities of catalase(CAT),glutathione peroxidase(GPx)and superoxide dismutase(SOD)were measured by xanthine oxidase.The kidney morphology was evaluated by periodic acid-Schiff(PAS).ResultsThe serum expression level of Cr and BUN in the IRI group were respectively(160.15±25.17)μmol/L and(90.22±16.17)mmol/L,which were significantly higher than(47.16±5.13)μmol/L and(23.11±3.28)mmol/L in the RGZ group(P＜0.05).The renal pathological damage score in the IRI group was(3±0.5)points,which was significantly higher(1±0.5)points in the RGZ group(P＜0.05).The serum expression level of TNF-α,IL-8 and IL-6 in the IRI group were(1 400±350)pg/mL,(1 200±300)pg/mL,(1 150± 250)pg/mL,respectively,which were all significantly higher than corresponding(650±150)pg/mL,(450±120)pg/mL, (550±170)pg/mL in the RGZ group(P＜0.05).The mRNA expression levels of TNF-α,IL-8,and IL-6 in the IRI groupwere(14.00±5.5),(11.00±4.3),(9.50±2.8),which were all significantly higher than corresponding(5.50±1.7),(6.40± 2.1),(3.80±1.3)in the RGZ group(P＜0.05).The content of MDA in the IRI group was(18.12±4.15)nmol/mg,which was significantly higher than(7.12±1.15)nmol/mg in the RGZ group(P＜0.05).The activation of CAT,GPX and SOD in the IRI group were(8.77±1.52)U/mg,(7.22±1.03)U/mg,and(6.54±1.22)U/mg,which were all significantly lower than (25.17±3.22)U/mg,(23.42±3.07)U/mg,(21.22±2.79)U/mg in the RGZ group(P＜0.05).The content of p-PPAR-γ in the IRI group was(0.32±0.07),which was lower than(0.51±0.11)in the RGZ group(P＜0.05).There was no difference between the IRI group and the RGZ group in the expression of PPAR-γ(P＞0.05).ConclusionPPAR-γ agonist rosiglitazone can attenuate renal iscmia reperfusion injury with reducing the renal pathological changes.The mechanism of which is related to inhibition of oxidative stress and inflammatory reaction.

Rosiglitazone(RGZ);Kidney ischemia reperfusion injury;Inflammation;Oxidative stress

R-332

A

1003—6350（2017）12—1901—04

2017-01-21)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.12.003

四川省醫院科技基金（編號：2016PY0)

羅京。E-mail：774067870@qq.com