檢測風疹病毒IgM抗體石墨烯/多壁碳納米管電化學傳感器的研制

廖昂+鄧啟明+董林玲+余燕飛+刁奇志+丁強

[摘要] 目的 研制基于石墨烯/多壁碳納米管檢測風疹病毒IgM抗體（RV-IgM）的電化學傳感器，并對其分析性能進行評價。 方法 將風疹抗原固定于經氧化態石墨烯（GS）、殼聚糖（CHI）、多壁碳納米管（MWCNT）、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM][PF6]-NH2）、金納米離子、硫堇納米材料等生物材料層層修飾的絲網印刷電極表面，并用辣根過氧化物酶進行封閉制得研究所用的電化學傳感器。使用循環伏安法對層層修飾后的傳感器電極進行測試，并對傳感器進行優化實驗，確定傳感器的最佳實驗條件。在最佳實驗室條件下，對傳感器的分析性能進行評價。 結果 裸電極經多種生物材料層層組裝后，電極峰電流逐漸增大；包被抗原及辣根過氧化物酶后，電極響應電流減弱。傳感器的最佳pH值及H2O2濃度分別為7.0和8.0 mmol/L，最佳孵育溫度及時間分別為35.0℃和30 min。傳感器檢測RV-IgM的重復性精密度及日間精密度分別為3.4%、4.9%；線性范圍為0.1～300 pg/mL，檢出限為40 fg/mL；回收率為97.5%，抗干擾性強。 結論 在最佳實驗條件下，組裝電化學傳感器與目前現有的檢測風疹病毒方法比較，具有靈敏度高、精密度和正確度較好、且快速簡便、可定量的優點。

[關鍵詞] 石墨烯/多壁碳納米管；電化學傳感器；風疹病毒；IgM抗體

[中圖分類號] R511.203 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（b）-0177-04

[Abstract] Objective To develop a electrochemical sensor based on multiwalled carbon nanotube-graphene for detection of the rubella virus IgM antibody and to evaluate its analytical performance. Methods Oxidized graphene （GS）， chitosan （CHI）， multi-wall carbon nano-tubes （MWCNT）， 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate （six-[BMIM][PF6]-NH2）， gold nanoparticles and thionine biological nanomaterial were used as materials to modify screen printing electrode by layer-by-layer self-assembly and then rubella antigen was immobilized on the assembled electrode surface， afterwards coated by horseradish peroxidase and eventually formed the electrochemical sensor used in this study. The layer-by-layer assembled electrode was scanned by cyclic voltammetry to detect its electrochemical performance. The optimum experimental conditions of the sensor were obtained by optimization experiments. The analytical performance of the sensor was evaluated under the optimum experimental conditions. Results After the bare electrode was assembled with above-mentioned materials， the peak current and conductivity of the electrode gradually increased， and the response current gradually decreased after being coated by antigen and horseradish peroxidase. The optimum pH value and H2O2 concentration were 7.0 and 8.0 mmol/L respectively. The optimum incubation temperature and time were 35.0℃ and 30 minutes respectively. The repeatability precision and inter-day precision of the detection of rubella virus IgM antibody were 3.4% and 4.9% respectively， the linear range was 0.1-300 pg/mL， the detection limit was 40 fg/mL， the recovery rate was 97.5%. And at the same time， the sensor had a good anti-interference performance. Conclusion Under the optimum experimental conditions， the assembled electrochemical sensor for detection of rubella virus has the advantages of higher sensitivity， better precision and accuracy， the rapid and simple operation and also quantifiability compared with the existing methods.

[Key words] Multiwalled carbon nanotube/grapheme； Electrochemical sensor； Rubella virus； IgM antibody

婦女妊娠期間，由于內分泌及免疫狀態的改變，感染風疹病毒風險也相應增加，從而引起流產或胎兒畸形，甚至死胎[1]。雖然風疹病毒疫苗的普及對預防其感染起到了重要作用，但體內抗體會隨著時間延長而逐漸降低。目前我國每年仍約有4萬名新生兒患先天性風疹綜合征。目前，檢測風疹病毒的實驗室方法主要為酶聯免疫吸附測定（ELISA）法和化學發光法，但這兩種方法均存在靈敏度較低、檢測時間較長且不能實時檢測的缺點。近年來電化學免疫傳感器因其高靈敏度、高特異性、可定量等優點逐步應用于疾病的診斷，檢測病毒抗原的檢測限可達到30 pg/mL[2]，因此研制用于檢測風疹病毒IgM抗體（RV-IgM）的電化學免疫傳感器可彌補目前實驗方法的不足。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電化學工作站購自上海辰華公司，H-7500透射電子顯微鏡為日本日立公司生產，一次性絲網印刷電極購自臺灣ZensorR&D公司。

1.2 材料

多壁碳納米管（MWCNT）（批號20131123）購自成都有機化學品有限公司；石墨烯（批號20140315）購自先豐納米科技有限公司；1-丁基-3甲基-6氟磷酸鹽購自上海晨杰化學品有限公司；殼聚糖（CHI）、辣根過氧化物酶、過氧乙酸購自上海生工生物科技有限公司；硫堇、氯金酸（批號20150308）購自美國Sigma公司。風疹抗原（批號20151103）購自美國Meridian公司，風疹IgM標準品（批號20151016）購自NIBSC。所有試劑均為分析純等級。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 電化學免疫傳感器的制備

根據文獻[3-5]制備離子液體-石墨烯（GS-[BMIM][PF6]），將GS-[BMIM][PF6]與生物保護劑CHI、MWC-NT混合，得到MWCNT-CHI-GS-[BMIM][PF6]納米復合材料，取該混合物滴加在絲網印刷電極中的工作電極表面，自然干燥1 d。隨后將金納米離子及硫堇先后滴在MWCNT-CHI-GS-[BMIM][PF6]修飾的絲網印刷電極表面，37℃自然干燥1 d，如此反復3次。最后在電極表面滴加8 ng的風疹抗原包被液，自然風干過夜，用蒸餾水進行沖洗，去除未固定的抗原，滴加5 μL 0.25% HRP溶液進行封閉，放置4℃冰箱保存備用。

2.1.2 傳感器的性能檢測

分別對石墨烯及納米金進行透射電鏡掃描。對層層修飾后的電極在含有0.1 mol/L氯化鉀的5 mmol/L Fe（CN）63-/4-溶液中使用循環伏安法從0.1～0.7 V進行掃描（掃描速度為0.05 V/s），得到不同的循環伏安圖。

2.1.3 實驗條件的優化

分別在不同的pH值溶液、不同濃度的H2O2溶液中對傳感器電極的響應電流進行檢測，響應電流最大，峰值電流的增幅最大時的pH值及H2O2濃度為最佳，以及在不同的孵育溫度、孵育時間，電極響應電流最低的孵育溫度及時間為最佳。

2.1.4 電化學免疫傳感器的分析性能測試

在以上實驗所得最佳實驗條件下對組裝的電化學傳感器進行性能測試。

2.1.4.1 標準曲線的制作及檢測限的檢測 使用研制的電化學傳感器，在最佳實驗條件下對不同濃度的RV-IgM標準品進行檢測，對所得實驗數據作線性回歸分析。同樣條件下對空白實驗液進行檢測，重復3次，計算出檢測限。

2.1.4.2 精密度測試 一天之內檢測濃度為100 U/mL RV-IgM 3次，連續檢測5 d，分別計算批內及批間精密度。

2.1.4.3 準確度驗證 取0.1 mL濃度為100 U/mL的RV-IgM標準品作為回收實驗管及不含RV-IgM的生理鹽水作為空白管，使用研制的傳感器分別對實驗管及空白管連續檢測3次，取均值作為回收實驗濃度及本底濃度，標準品濃度作為標準濃度，計算回收率，回收率=回收濃度/標準濃度×100%。

2.1.4.4 干擾實驗 分別將0.1 mL濃度為10 μg/mL的單純孢疹病毒IgG、類風濕因子和人乳頭狀瘤病毒IgG作為干擾物加入0.9 mL濃度為100 U/mL RV-IgM溶液中，作為實驗管，不含干擾物的同濃度的RV-IgM溶液作為對照管，進行測量。

2.1.5 統計學方法

使用SPPS 19.0統計軟件對上述數據進行統計分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，將干擾實驗的含干擾物質的實驗管測量結果分別與對照管測量結果進行配對t檢驗，P < 0.05，則干擾可接受。

2.2 結果

2.2.1 電鏡掃描結果

MWCNT-GS-Chit-[BMIM][PF6]納米復合材料經透射電子顯微鏡掃描結果見圖1。

2.2.2 傳感器的性能檢測結果

納米材料經層層修飾電極后，以0.05 V/s掃描速度對電極進行掃描，得到的循環伏安圖見圖2，可見隨著修飾材料的增加，電極電流逐漸增強。

2.2.3 實驗條件的優化

對實驗反應體系的最佳pH值、H2O2濃度、抗體的孵育時間及溫度的選擇進行優化實驗得出：最佳pH值為7.0，最佳H2O2濃度為8.0 mmol/L，最佳孵育溫度為35.0℃，最佳孵育時間為30 min。見圖3～6。

2.2.4 電化學免疫傳感器的分析性能測試結果

2.2.4.1 標準曲線及檢測限 回歸方程為Y = 0.2776X+5.4813，相關系數為0.98，線性范圍為0.1～300 pg/mL，檢測限為40 fg/mL。見圖7。

2.2.4.2 電化學免疫傳感器精密度測量結果 計算得出重復性精密度、批間精密度、日間精密度分別為3.4%、4.1%、4.9%。

2.2.4.3 電化學免疫傳感器正確度測量結果 回收實驗濃度及本底濃度均值分別為97.8、0.03 U/mL，由此計算的回收濃度（回收實驗濃度-本底濃度）及回收率分別為97.5 U/mL及97.5%。

2.2.4.4 抗干擾實驗結果 對照管濃度為（89.96±3.52）U/mL，含單純孢疹病毒IgG、類風濕因子和人乳頭狀瘤病毒IgG干擾物質的實驗管濃度分別為（90.52±3.51）、（89.87±3.12）、（90.78±3.76）U/mL，對照管濃度與以上實驗管濃度比較差異無統計學意義（均P > 0.05）。

3 討論

CHI含大量羥基和氨基，對生物大分子及有機小分子具有較強的吸附能力，且具有良好的生物相容性、滲透性及成膜性，但導電性能較差，而石墨烯是目前已知最薄的二維材料，與MWCNT一樣具有較高的比表面積（2630 m2/g）及導電性能[8-9]，但其不溶于水，易聚集。本研究使用[BMIM][PF6]-NH2與石墨烯反應，解決了這個問題，得到溶解均勻的離子液體石墨烯。加入石墨烯、MWCNT及納米金可彌補CHI導電性較差的缺陷。從層層修飾電極的循環伏安圖可以看出：未組裝前裸電極由于缺乏電子媒介體，CV圖為一對平坦的氧化還原峰曲線，通過層層修飾后，電極的峰電流逐漸增大，結果證明電極通過層層修飾后具有良好的電化學特性。由于不適合的pH值及H2O2濃度會影響抗原及抗體的活性，同樣，抗體孵育溫度及時間會影響抗原抗體結合效率，從而影響整個實驗的效果。因此，需對以上條件進行優化實驗。本研究結果顯示，在最佳實驗條件下，傳感器電極的響應電流與RV-IgM濃度的對數值具有較好的負相關關系。與現有檢測方法比較，具有較高的靈敏度（檢測限為40 fg/mL）、較好的精密度和正確度[11-12]。如使用成品的組裝電極，整個檢測時間可縮短至30～40 min，所以該方法不失為一種檢測RV-IgM的良好方法。但組裝好的成品免疫電極的穩定性也許會對檢測結果有所影響，目前我們未做這方面的研究，如果成品免疫電極在4℃的穩定性能能超過半年，則可廣泛應用于RV-IgM的臨床檢測。

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（收稿日期：2017-01-21 本文編輯：張瑜杰）