趨化因子受體CXCR4及基質金屬蛋白酶9在非小細胞肺癌中的表達及其對預后的意義

黃衍楊，吳潤華

趨化因子受體CXCR4及基質金屬蛋白酶9在非小細胞肺癌中的表達及其對預后的意義

黃衍楊1，2，吳潤華1

目的 探討趨化因子受體CXCR4及基質金屬蛋白酶MMP-9在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達及臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法檢測51例NSCLC患者癌組織及癌旁組織中CXCR4和MMP-9蛋白的表達情況，分析CXCR4和MMP-9蛋白表達與NSCLC臨床病理特征及預后的關系。結果 CXCR4和MMP-9蛋白在癌組織中的表達陽性率均高于癌旁組織，差異有統計學意義(均P<0.05)；NSCLC癌組織中CXCR4及MMP-9的表達與腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移相關(均P<0.05)；癌組織中CXCR4表達與MMP-9表達呈顯著正相關(P<0.05)，Cox回歸分析提示CXCR4和MMP-9蛋白表達、腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移是影響NSCLC預后的獨立因素(均P<0.05)。結論 CXCR4及MMP-9可能參與了NSCLC發生發展過程，二者高表達提示NSCLC患者預后不良，聯合檢測CXCR4及MMP-9的表達可更好地評估NSCLC患者的預后。

非小細胞肺癌；趨化因子；基質金屬蛋白酶；預后

肺癌作為全球范圍最為常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率一直居高不下[1]。最新的臨床統計資料表明，2015年我國惡性腫瘤新發病例429.2萬例，其中肺癌新發病例73.3萬例，其發病率在男性惡性腫瘤中位居首位，而在女性中肺癌發病率也僅次于乳腺癌。2015年全國惡性腫瘤死亡病例281.4萬例，其中肺癌死亡病例61萬例，約占22%，位居我國惡性腫瘤死亡率首位[2]。資料表明90%以上肺癌病理類型為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[3]，盡管近年來NSCLC的診斷治療方面已取得較大進步，但總體療效仍不理想，5 a生存率仍然不足20%[1]，且對于NSCLC的發生及發展過程的相關分子機制仍不明確。新近研究表明趨化因子受體CXCR4可能與NSCLC腫瘤細胞增殖侵襲轉移相關[4]?；|金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)已被證實在多種惡性腫瘤的侵襲轉移過程中發揮作用。研究發現CXCR4可能通過上調基質金屬蛋白酶的表達而促進體外NSCLC細胞株的轉移潛能[5]。本研究擬對CXCR4及MMP-9在NSCLC中表達的相關性及其與NSCLC患者臨床病理特征、預后的關系進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本研究選取作者醫院2008年至2010年治療的原發性NSCLC患者51例(排除其他腫瘤并發者)，所有病例收集癌組織及距離癌組織3 cm以上的癌旁組織。所有患者術前或者收集標本前均未進行化療、放療等治療，術后或者無法手術者均根據指南進行相應的輔助治療。其生存期從確診之日開始計算，終止日期為死亡日期或者末次隨訪日期，截止日期為2016年12月31日。所有病例均經病理組織學確診為原發性NSCLC，均有完整的病例資料。

1.2 主要試劑 兔多抗CXCR4、MMP-9購自Abcam公司，Elivision試劑盒、胃蛋白酶、H2O2及內源性生物素阻斷試劑盒均購自福州邁新生物技術公司。

1.3 免疫組織化學檢測 所有組織標本均經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm 連續切片，采用免疫組織化學Elivision法染色，嚴格按照試劑盒說明方法操作。石蠟切片脫蠟水化，高溫枸櫞酸鹽煮沸抗原修復，3%H2O2孵育，生物素阻斷劑阻斷；分別加入一抗CXCR4、MMP-9多克隆抗體，工作液稀釋比例均為1∶100，加入二抗反應，DAB顯色，脫水，透明，封固。已知的陽性切片作陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學結果判定 兩位病理科醫師顯微鏡下獨立觀察，隨機采集10個具有代表性的視野，根據染色陽性腫瘤細胞比例及染色強度進行評分。染色陽性細胞評分標準：①0分，≤10%；②1分，11%～30%；③2分，31%～50%；④3分，≥50%。染色強度評分標準：①0分，無染色；②1分，弱表達染色；③2分，中度表達染色；④3分，強表達染色。二者相加≥4分為該基因表達陽性。

1.5 統計學方法 運用SPSS 19.0軟件進行統計分析。其中CXCR4、MMP-9表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，Spearman分析CXCR4、MMP-9表達的相關性，總體生存率采用Kaplan-Meier法分析，多因素Cox回歸分析綜合評價各因素對患者預后生存的影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXCR4、MMP-9的表達 免疫組織化學染色結果顯示CXCR4、MMP-9在NSCLC癌組織中均呈強-中等強度陽性表達，陽性定位于細胞質及細胞膜上，而癌旁組織中僅散在弱表達于肺泡上皮細胞、漿細胞中，見圖1-2。CXCR4和MMP-9蛋白在癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，差異具有統計學意義(均P<0.05)，見表1。

A：癌組織 B：癌旁組織圖1 MMP-9的表達(DAB，×400)

A：癌組織 B：癌旁組織圖2 CXCR4的表達(DAB，×400)

表1 CXCR4、MMP-9在NSCLC的表達 例

注：P<0.05為差異有統計學意義。

2.2 CXCR4、MMP-9的表達與臨床病理特征 CXCR4的表達與NSCLC的年齡、性別、吸煙與否、組織病理類型及惡性分化程度無明顯相關性(均P>0.05)，而與腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移相關(均P<0.05)；MMP-9的表達與NSCLC的年齡、性別、吸煙與否、組織病理類型及惡性分化程度亦無明顯相關性(均P>0.05)，也與腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移相關(均P<0.05)，見表2。

表2 CXCR4、MMP-9的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.3 CXCR4和MMP-9的相關性分析 Spearman相關分析顯示NSCLC癌組織中CXCR4和MMP-9的表達呈正相關(r=34.895，P<0.05)，而在癌旁組織中CXCR4和MMP-9的表達并無相關性(rs=1.482，P=0.223)，見表2。

2.4 CXCR4、MMP-9表達與生存期 CXCR4、MMP-9表達陽性的患者生存率低于CXCR4、MMP-9表達陰性者，差異有統計學意義(均P<0.05)，見表3。

表3 NSCLC患者預后影響因素分析

2.5 影響預后的Cox風險模型多因素分析 對可能影響NSCLC預后的相關因素：CXCR4和MMP-9表達、腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移等進行多因素Cox風險模型分析，結果提示CXCR4和MMP-9表達、腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移均是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素。

3 討論

眾多研究表明細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的降解在惡性腫瘤細胞的侵襲轉移過程中扮演重要角色?；|金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinases,MMPs)是一類鋅離子依賴的蛋白內切酶，是人體內降解ECM的主要酶系。其中MMP-9又被稱為Ⅳ型膠原酶，主要降解ECM基底膜的Ⅳ型膠原及層粘連蛋白而破壞基底膜的完整性，從而促進惡性腫瘤細胞的侵襲轉移[6]。研究表明MMP-9的抑制劑則可通過降低腫瘤組織細胞中MMP-9的表達及活性而抑制腫瘤細胞的侵襲轉移[7-8]。Lee等用免疫組織化學法檢測了417例NSCLC癌組織中MMP-9的表達情況(其中腺癌患者202例，鱗癌患者175例，其他病理類型40例)，發現腺癌組織MMP-9的表達陽性率顯著高于鱗癌組織，MMP-9的表達與NSCLC患者的TNM分期、淋巴結轉移相關，并且肺腺癌患者中MMP-9的表達與患者的預后差相關[9]。然而Zhang等檢測了132例手術治療的NSCLC癌組織中MMP-9的表達情況(其中腺癌53例，鱗癌79例)，卻發現肺鱗癌MMP-9的表達量要顯著高于肺腺癌患者[10]。Gong等檢測了163例NSCLC血清MMP-9水平及活性，發現血清MMP-9活性與NSCLC的T分期及遠處轉移相關，并對22份相關研究進行分析，發現NSCLC MMP-9的過表達與患者TNM分期及預后差相關[11]。

本研究應用免疫組織化學法檢測NSCLC癌組織及癌旁組織中MMP-9的表達，發現MMP-9在NSCLC癌組織中呈強-中等強度陽性表達，陽性定位于細胞質及細胞膜上，而癌旁組織中僅于肺泡上皮細胞、漿細胞中少量表達，并且癌組織中MMP-9表達陽性率顯著高于癌旁組織，提示MMP-9高表達可能參與NSCLC的發生。另外，本研究發現MMP-9的表達與NSCLC腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移及遠處轉移相關，然而與病理組織類型及組織分化程度無明顯相關性。另外生存分析發現MMP-9表達陽性的NSCLC生存期顯著短于MMP-9表達陰性患者，多因素Cox分析發現MMP-9表達、腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移均是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素，提示MMP-9表達可作為NSCLC患者預后差的指標，與Lee及Gong等報道一致。

趨化因子受體是一類具有跨膜結構的G蛋白偶聯受體，研究表明趨化因子受體家族通過與其特異性配體結合的方式參與了惡性腫瘤的發生發展。最早由Muller等于2001年首先報道人乳腺癌細胞中高度表達趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌常見的轉移部位淋巴結及肺臟等組織中其相應配體CXCL12的表達也相應增加，提示CXCR4/CXCL12可能參與了乳腺癌的侵襲轉移過程[12]。Choi等研究分別從動物和細胞水平證實了CXCR4通過CXCL12介導了NSCLC的侵襲轉移行為[4]。Zhang等對研究的19份1 872個病例進行分析，發現NSCLC中CXCR4表達顯著高于正常肺組織，NSCLC患者癌組織中CXCR4的表達與臨床分期、遠處轉移及預后差相關[13]。

本研究結果提示CXCR4與MMP-9同樣在NSCLC癌組織中呈強-中等強度陽性表達，陽性定位于細胞質及細胞膜上，而癌旁組織中僅散在弱表達于肺泡上皮細胞、漿細胞中。并且，CXCR4在NSCLC癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織，同時CXCR4在NSCLC癌組織中的表達與NSCLC腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結及遠處轉移相關，與胡婷華等報道一致[14]，提示CXCR4的表達可能參與NSCLC的發生發展。生存分析發現CXCR4表達陽性的NSCLC生存期也顯著短于CXCR4表達陰性患者，多因素Cox分析發現CXCR4表達也是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素，與Zhang等報道一致。Mir等研究表明CXCR6可能介導MMPs表達增加而增強NSCLC細胞株的增殖及侵襲遷移能力[15]。石鋒的細胞實驗發現CXCL12/CXCR4分泌環促進了NSCLC細胞株的增值侵襲遷移能力，并上調了MMP-2及MMP-9的表達，提示CXCL12/CXCR4可能通過分泌MMP-2、MMP-9表達增加而促進NSCLC細胞株的侵襲轉移潛能[5]。本研究發現NSCLC癌組織中CXCR4蛋白表達與MMP-9蛋白顯著正相關，提示聯合檢測CXCR4及MMP-9的表達可能更好地評估NSCLC患者預后。然而NSCLC癌組織中CXCR4與MMP-9之間究竟存在怎樣的通路關系，仍然有待進一步研究。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[2] Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[3] Rami-Porta R,Bolejack V,Giroux DJ,et al.The IASLC lung cancer staging project: the new database to inform the eighth edition of the TNM classification of lung cancer[J].J Thorac Oncol,2014,9(11):1618-1624.

[4] Choi YH,Burdick MD,Strieter RM,et al.CXCR4,but not CXCR7,discriminates metastatic behavior in non-small cell lungcancer cells[J].Mol Cancer Res,2014,12(1):38-47.

[5] 石鋒,郭蘋.CXCL12/CXCR4自分泌環對人非小細胞肺癌細胞株A549轉移潛能的影響[J].廣東醫學,2016,37(10):1442-1446.

[6]Vandooren J,VandenSteen PE,Opdenakker G.Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2013,48(3):222-272.

[7]Shi M,Cao M,Song J,et al.PinX1 inhibits the invasion and metastasis of human breast cancer via suppressing NF-kappaB/ MMP-9 signaling pathway[J].Mol Cancer,2015,14:66.

[8] Xia Y,Lian S,Khoi PN,et al. Chrysin inhibits tumor promoter-induced MMP-9 expression by blocking AP-1 via suppression of ERK and JNK pathways in gastric cancer cells[J].PLoS One,2015,10(4):e0124007.

[9] Lee CY,Shim HS,Chung KY,et al.Prognostic effect of matrix metalloproteinase-9 in patients with resected non small cell lung cancer[J].J Cardiothorac Surg,2015,10(44):1-8.

[10]Mu MK,Song Y,Zhang B.Expression and survival significance of B-cell-specific moloney murine leukemia virus integration site 1 and matrix metalloproteinase-9 in non-small-cell lung cancer[J].Oncol lett,2016,12(5):3715-3722.

[11]Gong L,Wu D,Yuan HJ,et al.Prognostic impact of serum and tissue MMP-9 in non-small cell lung cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Oncotarget,2016,7(14):18458-18465.

[12]Muller A,Homey B,Zlotnik A,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature,2001,410(6824):50-56.

[13]Zhang CY,Li J,Han Y,et al.Ameta-analysis for CXCR4 as a prognostic marker and potential drug target in non-small cell lung cancer[J].Drug Des Devel Ther,2015,9:3267-3278.

[14]胡婷華,姚煜,南克俊,等.非小細胞肺癌組織中CXCR4和Nrf2的表達及其臨床意義[J].南方醫科大學學報,2014,34(2):153-158.

[15]Mir H,Singh R,Singh S,et al.CXCR6 expression in non-small cell lung carcinoma supports metastatic process via modulating metalloproteinases[J].Oncotarget,2015,6(12):9985-9998.

Expression of CXCR4 and MMP-9 in Non-small Cell Lung Cancer and Its Clinical Prognosis

HUANG Yan-yang1,2, WU Run-hua1

(1.Teaching Center for Clinical Skill,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People′s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350004, China)

ObjectiveTo investigate the expression of CXCR4 and MMP-9 in non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues, and analyze their clinical prognosis significance.MethodsThe expressions of CXCR4 and MMP-9 proteins were detected by immunohistochemistry in tumor tissues and corresponding adjacent normal tissue from 51 NSCLC patients. The relationship between CXCR4 and MMP-9 expression in tumor tissues and clinicopathological characteristics and prognosis of NSCLC were analyzed.ResultsThe positive expression rates of CXCR4 and MMP-9 proteins in tumor tissues were significantly higher than those in the corresponding adjacent normal tissue(allP<0.05). A high expression rate of CXCR4 and MMP-9 were significantly associated with tumor size, TNM stage, lymph node metastasis and distant metastasis(allP<0.05). There was a positive correlation between CXCR4 and MMP-9 expression in tumor tissues. Cox regression analysis indicated that the expression of CXCR4 and MMP-9, tumor size, TNM stage, lymphnode metastasis and distant metastasis or not were independent predictors of prognosis for NSCLC.ConclusionCXCR4 and MMP-9 might be involved in the development of NSCLC malignant process, and their high expression might indicate poor prognosis in patients with NSCLC.

non-small cell lung cancer；chemokine；matrix metalloproteinases；prognosis

1672-688X(2017)02-0092-05

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.004

2017-04-25

1.福建中醫藥大學臨床技能教學中心，福建福州 350122 2.福建中醫藥大學附屬人民醫院肺病科，福建福州 350004

黃衍楊(1983—)，男，福建龍巖人，醫師，從事呼吸病學臨床工作。

吳潤華，女，博士，講師，E-mail：wu_runhua@126.com

R734.2

A