UPLC-MS/MS檢測果蔬飲料中痕量吡蟲啉

王新梅

（瓊臺師范學院，海南?？?71127）

UPLC-MS/MS檢測果蔬飲料中痕量吡蟲啉

王新梅

（瓊臺師范學院，海南?？?71127）

建立一種快速、有效的超高效液相色譜-串聯質譜法測定果蔬飲料中痕量吡蟲啉農藥殘留的方法。樣品經0.1%醋酸-乙腈提取后，采用氨基固相萃取小柱進行凈化和富集。采用Waters Atalantis T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）分離，以0.1%甲酸-乙腈為流動相的梯度洗脫模式下，吡蟲啉標準在0.5 ng/mL～50.0 ng/mL濃度范圍內線性良好，相關系數r2為0.999，檢出限為0.15 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg，加標回收率達到93.2%～96.9%。

超高效液相色譜-串聯質譜；吡蟲啉；農藥殘留

吡蟲啉是新一代氯代尼古丁殺蟲劑，目前世界范圍內的使用量已居所有殺蟲劑的首位[1-3]。該物質會對人類和哺乳動物產生慢性毒理效應，0.05 mg/kg的吡蟲啉就會損害人體淋巴細胞的遺傳物質DNA[4]，近年來，隨著吡蟲啉在果蔬產品中的使用量的逐年增加，其殘留量受到廣泛關注。然而由果蔬產品制成的果蔬飲品卻研究不多，而且果蔬變成果蔬飲品后原有成分會被稀釋，加之對檢測方法靈敏度不夠等原因，果蔬飲料中微量的農藥殘留很難被檢測到。

對于吡蟲啉檢測方法主要有GC-MS、HPLC等方法[5-13]，本試驗利用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測果蔬飲料中的吡蟲啉農藥殘留，能夠在原有的高效液相色譜法上使得檢出限和靈敏度提高一個等級，可用于檢測果蔬飲料中痕量吡蟲啉的農藥殘留。本研究對果蔬飲料的前處理過程采用固相萃取技術，可以對樣品中的目標物起到凈化和富集的作用，操作簡便，凈化效果好，可以為吡蟲啉在果蔬飲料中的痕量殘留研究提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料儀器與試劑

材料：樣品均隨機購于超市。

Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；API4000四極桿串聯質譜儀：美國AB公司。

吡蟲啉標準品：國家標準物質中心；甲醇、乙腈為色譜純：美國Fisher Scientific公司。

氨基固相萃取小柱：Waters公司，規格3cc，250mg。

1.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersAtalantisT3（2.1mm×150mm，3μm）；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相 A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫程序：0～5.0 min 70%A；5.0 min～8.0 min 70%A →20%A；8.0 min～14.0 min 20%A →70%A；15.0 min 70%A。

1.3 方法

1.3.1 流動相體系的選擇

本試驗主要比較流動相A：純水、0.1%甲酸水溶液，以及流動相B：甲醇、乙腈的不同組合對吡蟲啉色譜行為的影響。

1.3.2 質譜條件的優化

采用針泵連續進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，先對目標物進行母離子全掃描，然后對其子離子進行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數進行優化。

1.3.3 標準曲線的制作

稱取相應質量的吡蟲啉標準品，配制成濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL 的標準溶液，進行液相-質譜分析，繪制標準曲線。

1.3.4 樣品前處理條件的優化

果蔬飲料中除了固有的一些食品基質外，還含有很多人為添加的營養元素，成分復雜，對前處理要求高，所以本試驗樣品比較幾種常用的溶劑提取效果；再利用氨基固相萃取小柱，對吡蟲啉農藥殘留起到一個凈化和富集的作用，并對4種固相萃取小柱進行比較，選擇較合適的固相萃取小柱。

1.3.5 加標回收試驗及樣品測定

以市售未檢測出吡蟲啉殘留的果蔬飲料為空白基質，加入標準溶液，選擇優化后的前處理條件操作，過固相萃取柱，上機檢測，計算回收率。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

參考相關標準和文獻[14-20]，發現不同標準文獻檢測吡蟲啉農藥殘留的流動相體系不同，本試驗主要比較幾種不同體系的流動相：純水、0.1%甲酸水溶液為流動相A，以及甲醇、乙腈為流動相B的流動相體系效果。

結果發現，在流動相體系A中添加甲酸后，既有利于目標物的離子化，提高目標物的響應值，又有利于改善其峰形；流動相體系B中乙腈相比甲醇，洗脫能力強，可減少樣品中的雜質在色譜柱中的殘留，延長色譜柱的壽命。因此本試驗的流動相體系選擇0.1%甲酸水為流動相A，乙腈為流動相B，采用優化后的色譜條件，吡蟲啉出峰時間為4.71 min，靈敏度高，峰形尖銳，如圖1所示。

圖1 吡蟲啉總離子流圖及子離子的提取離子色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of imidacloprid

2.2 質譜條件的優化

采用針泵連續進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，對濃度為10 ng/mL的吡蟲啉的標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子，優化各母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎上，對其子離子進行全掃描，選擇兩組豐度最高的離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數進行優化。

優化后的質譜參數為：噴霧電壓5 500 V、離子源溫度500℃、氮氣流量30 L/min、掃描停滯時間100 ms，其他質譜參數見表1。

2.3 標準曲線的制作

為了驗證吡蟲啉標準品在2.2優化后超高效液相-質譜條件下的線性關系，配制了濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL的系列標準溶液。試驗結果表明，吡蟲啉在0.5 ng/mL～50.0 ng/mL內均具有良好的線性關系，其線性回歸方程及相關系數見表2，并計算得到吡蟲啉組分的檢出限為 0.15 μg/kg，定量限為 0.50 μg/kg。

2.4 提取溶劑的選擇

根據對吡蟲啉的化學結構的分析[21-22]，可以得知其屬于極性物質，不溶或難溶于水，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有機溶劑。但由于市售不同種類的果蔬飲料中都存在一定量的固形物，直接用有機溶劑萃取時容易發生乳化現象。所以在提取溶劑中一般都會加入少量的酸，吡蟲啉與酸結合成鹽時，加強了極性，不易產生乳化現象，還有利于提高吡蟲啉的提取效率。所以本試驗比較了甲醇、乙腈以及0.1%甲酸-乙腈和0.1%醋酸-乙腈等4種提取溶劑對吡蟲啉提取效果的影響。

表2 吡蟲啉的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of imidaeloprid

表3 不同提取溶劑對吡蟲啉回收率的影響Table 3 The effect of different extract solution on the recovery rate of imidaeloprid

結果如表3所示，在添加相同量的目標物時，0.1%醋酸-乙腈作為提取溶劑時，目標物的檢出量最高。當以甲醇提取時，樣品易產生渾濁現象，吡蟲啉的回收率最低；當乙腈作為提取溶劑，并添加少量酸以后，目標物的回收率較理想；當0.1%甲酸-乙腈為提取溶劑時，回收率達到90.2%，但RSD較大；當0.1%醋酸-乙腈為提取溶劑時，得到目標物的回收率最高，其回收率達到92.8%，且RSD較小，所以選擇1%醋酸-乙腈為樣品中吡蟲啉農藥殘留的提取溶劑。

2.5 固相萃取小柱的選擇

固相萃取法以其集樣品提取、濃縮、凈化于一體，簡化了操作步驟，減少了溶劑用量，提高了樣品前處理效率而受到重視。固相萃取法中，針對樣品吡蟲啉殘留的檢測大部分是利用氨基小柱進行凈化[23-25]。本試驗中為驗證氨基小柱在果蔬飲料樣品凈化中的應用優勢，與其他常用的弗羅里硅柱、氧化鋁柱以及C18固相萃取小柱的凈化效果進行比較。結果如圖2所示。

發現氨基小柱前處理效果最好，平均回收率可以達到92.5%～95.8%。氨基小柱前處理果蔬飲料樣品，可以去除試樣中的天然色素、糖類等大分子組分，凈化后雜質干擾較少，顏色比較淺，回收率能滿足分析測定的需求。

圖2 不同固相萃取小柱對吡蟲啉回收率的影響Fig.2 The effect of different solid phase extraction column on the recovery rate of imidaeloprid

2.6 加標回收率與相對標準偏差

在以上試驗的優化條件下，利用空白基質的果蔬飲料樣品進行加標回收率試驗，在分別添加30、60、90 μg/kg共3個梯度濃度的標準混合溶液，每個濃度平行測定5次，測定結果見表4。

表4 方法的加標回收率及相對標準偏差（n=5）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表4可見，吡蟲啉的加標回收率為93.2%～96.9%，相對標準偏差（RSD）為2.2%～3.1%，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

2.7 實際樣品的測定

應用本試驗所建立的方法，對市售不同類型果蔬飲料共20個批次進行測定，19個批次未發現上述吡蟲啉農藥殘留，1個批次果蔬飲料中吡蟲啉的濃度為12.6 μg/kg，但是未超出 GB 2763-2014《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定的殘留限量（≤0.05 mg/kg）[26]。并對20批次的果蔬飲料按照GB/T 23379-2009《水果、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留的測定高效液相色譜法》復測（此方法檢出限0.02 mg/kg）[14]，結果未檢測出陽性樣品，表明本研究在用于實際樣品中痕量吡蟲啉殘留的測定中有一定的優勢。

3 結論

本文建立了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定果蔬飲料中痕量吡蟲啉農藥殘留的分析方法。結果表明，在0.1%甲酸-乙腈流動相體系中，吡蟲啉能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。在優化后的質譜條件下，樣品經過1%醋酸-乙腈提取后，再處理采用氨基固相萃取柱法可有效去除樣品中的復雜基質，可實現對目標物的凈化與富集，樣品中吡蟲啉的加標回收率為93.2%～96.9%，相對標準偏差（RSD）為2.2%～3.1%，能準確快速有效地檢測果蔬飲料中痕量的吡蟲啉農藥殘留。

[1] 朱永和,王振榮,李布青.農藥大典[M].北京:中國三峽出版社,2006:52-53

[2] 張一賓,張擇.世界農藥新進展[M].北京:化學工業出版社,2007:74-75

[3] 劉長令.世界農藥大全:殺蟲劑卷[M].北京:化學工業出版社,2012:178-179

[4] 封少龍,孔志明,王五香.吡蟲啉和抑食肼對人體周圍淋巴細胞遺傳物質的影響[J].癌變·畸變·突變,2002,14(4):210-213

[5] 張雪輝,杜雨倩,徐芳,等.高效液相色譜法檢測蔬菜中的吡蟲啉殘留[J].現代食品科技,2012,28(4):466-468

[6] 房超,董雷玲,宋陽威.高效液相色譜法同步檢測橙汁飲料中多菌靈、吡蟲啉殘留量[J].江蘇農業科學,2012,40(9):295-297

[7] 王鳳池,高文惠,呂紅英.固相萃取凈化高效液相色譜法測定玉米中吡蟲啉[J].食品科技,2006(8):259-262

[8] 陳迎麗,林紹霞,何鈺.HPLC-MS/MS法分析18%吡蟲啉·氟酰脲懸浮劑含量[J].農藥,2016(12):898-900

[9] 苗雪雪,楊愿愿,劉登彪,等.分散液液微萃取-氣質聯用法測定牛奶中酰胺類除草劑[J].華南農業大學學報,2015(2):43-48

[10]張亮,孫劍寧,熊先貴,等.QuEChERS-高效液相色譜檢測土壤中的吡蟲啉[J].色譜,2015,33(3):228-234

[11]DiMuccioA,FidenteP,AttardBarbiniD,et al.Application of solidphase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry to the determination of neonicotinoid pesticide residuesin fruit and vegetables[J].J Chromatogr A,2006,1108(1):1-6

[12]WatanabeE,BabaK,EunH,et al.Simultaneous determination of neonicotinoid insecticides in agricultural samples bysolid-phase extraction cleanup and liquid chromatography equipped with diodearraydetection[J].JAgric Food Chem,2007,55(10):3798-3804

[13]Pourreza N,Rastegarzadeh S,Larki A.Determination of fungicide carbendazim in water and soil samples using dispersive liquid-liquid microextraction and microvolume UV-vis spectrophotometry[J].Talanta,2015,134(1):24-29

[14]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB/T 23379-2009水果、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留的測定高效液相色譜法[S].北京:中國標準出版社,2009

[15]中華人民共和國農業部.NY/T 1275-2007蔬菜、水果中吡蟲啉殘留量的測定[S].北京:中國標準出版社,2007

[16]中華人民共和國農業部.NY/T 1724-2009茶葉中吡蟲啉殘留量的測定高效液相色譜法[S].北京:中國標準出版社,2009

[17]中華人民共和國農業部.NY/T 1727-2009稻米中吡蟲啉殘留量的測定高效液相色譜法[S].北京:中國標準出版社,2009

[19]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 1902-2007水果蔬菜中吡蟲啉、吡蟲清殘留量的測定高效液相色譜法[S].北京:中國標準出版社,2007

[20]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 2073-2008進出口植物性產品中吡沖啉殘留量的檢測方法液相色譜串聯質譜法[S].北京:中國標準出版社,2008

[21]黃超群,謝文,于卓然,等.液相色譜-串聯質譜法測定果蔬中10種酰胺類農藥的殘留量[J].食品安全質量檢測學報,2015(3):886-892

[22]趙風年,石夢琪,李輝.分散固相萃取-液質聯用法檢測玉米中4種農藥[J].食品研究與開發,2016(4):128-132

[23]黃優生,熊華亮,萬偲,等.液相色譜串聯質譜法同時檢測茶葉中23種農藥殘留[J].食品研究與開發,2014,35(21):81-85

[24]張璇,姜敏,何錦惠.高效液相色譜-質譜聯用儀測定韭菜中多菌靈、吡蟲啉等7種農藥殘留量[J].農業科學與管理,2016(3):41-47

[25]Zeying He,Lu Wang,Yi Peng,et al.Multiresidue analysis of over 200 pesticides in cereals using a QuEChERS and gas chromatography-tandem mass spectrometry-based method[J].Food Chemistry,2015,169(15):372-380

[26]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會,中華人民共和國農業部.GB 2763-2014食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量[S].北京:中國標準出版社,2014

Determination of Trace Imidaeloprid in Fruit and Vegetable Drink by UPLC-MS/MS

WANG Xin-mei
（Qiongtai Normal University，Haikou 571127，Hainan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of trace imidaeloprid pesticide residue in fruit and vegetable drink by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UHPLC-MS/MS）.After the sample was extracted by 0.1%acetic acid-acetonitrile，it concentrated and purified by amino solid phase extraction column.The separation of targeted compound was performed on a Waters Atalantis T3 chromatographic column（2.1 mm×150 mm，3 μm）using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of imidaeloprid was in the range of 0.5 ng/mL-50.0 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999.The detection limit was 0.15 μg/kg and the quantitative limit was 0.5 μg/kg.The recovery rate was 93.2%-96.9%.

ultra performance liquid chromatography tandem massspectrometry；imidaeloprid；pesticide residue

2017-03-02

王新梅（1979—），女（漢），講師，本科，研究方向：化學教育。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.036