歸芪益元膏對重離子輻射旁效應損傷大鼠的影響

張朝寧，李金田，劉永琦，藺興遙，李雪燕，孫少伯，李娟，王萌，陳繼堯

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歸芪益元膏對重離子輻射旁效應損傷大鼠的影響

張朝寧，李金田，劉永琦，藺興遙，李雪燕，孫少伯，李娟，王萌，陳繼堯

甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州 730000

目的 觀察歸芪益元膏對重離子輻射旁效應損傷大鼠的影響，探討其可能的作用機制。方法 將42只SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為空白對照組、單純輻射組和歸芪益元膏組。歸芪益元膏組預先給予歸芪益元膏灌胃2周，單純輻射組和歸芪益元膏組大鼠右肺予2 Gy12C6＋離子束單次照射，空白對照組不予照射。照射后6、12、24 h處死各組大鼠，檢測外周血象及白細胞介素（IL）-6、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、IL-1β含量，HE染色觀察大鼠肺組織病理形態。結果 與空白對照組比較，照射后12 h單純輻射組大鼠血清IL-6、TGF-β1、IL-1β含量明顯升高（＜0.01），外周血白細胞、紅細胞、血小板、血紅蛋白明顯下降（＜0.01）；HE染色顯示照射后24 h大鼠肺泡壁增厚，肺泡腔內有滲出物及炎性細胞浸潤等病理改變。與單純輻射組12 h比較，歸芪益元膏組12 h大鼠IL-6、TGF-β1、IL-1β含量明顯下降（＜0.01），血常規各項指標顯著上升（＜0.01），大鼠肺組織病理損傷有一定的改善。結論 歸芪益元膏對重離子輻射旁效應損傷具有防護作用。

輻射旁效應；重離子；歸芪益元膏；轉化生長因子-β1；白細胞介素-6；白細胞介素-1β；大鼠；雄性

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病，放療是治療惡性腫瘤的重要手段之一。重離子因具有高線性傳能密度、高能量沉積峰、相對高的生物學效應等優點，成為理想的腫瘤放療用射線[1-2]，但重離子放療時也會對周圍健康組織產生間接損傷，即輻射旁效應。輻射旁效應的機制目前尚未完全研究清楚，其防護是輻射生物學和臨床放療治癌領域的重要研究內容。中藥因高效、低毒、防治結合等優點成為目前輻射防護劑的研究熱點[3]。歸芪益元膏源自清?程國彭《醫學心悟》黃芪湯，加甘肅道地藥材當歸而成，全方具有益氣滋陰、補肺益腎、養血活血的功效。本實驗用歸芪益元膏對重離子輻射旁效應損傷大鼠預先干預，觀察其對重離子輻射旁效應的防護作用，并探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康雄性Wistar大鼠42只，2～3月齡，體質量（200±20）g，甘肅中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（甘）2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級實驗動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥物及制備

歸芪益元膏（黃芪、當歸、熟地黃、麥冬、人參、枸杞子、五味子），方中原藥材均由本校甘肅省高校中藏藥化學與質量控制實驗室魏舒暢教授提供并質量鑒定，符合國家藥典標準。按處方劑量稱取藥材后，以水作溶劑，提取2次，第1次用水量為總藥材劑量的8倍，第2次為總藥材劑量的6倍，每次提取2 h。合并2次提取的藥液，300目濾布過濾，減壓濃縮，制成膏劑，甘肅中醫藥大學中藥制藥實驗室完成。

1.3 主要試劑與儀器

白細胞介素（IL）-6、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、IL-1β試劑盒，北京欣博盛生物科技有限公司，批號R160315-003a、R160315-007a、R160707-107a。全自動動物血球分析儀（蘭橋醫學科技有限公司），低溫高速離心機（Kendro公司，型號D37520），酶標儀（瑞士TECAN公司，型號Infinite F200），石蠟切片機、石蠟包埋機、石蠟脫水機（德國Leica公司），普通光學顯微鏡（日本OLYMPUS，型號BX-51）。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

采用隨機數字表法將大鼠分為空白對照組（6只）、單純輻射組（18只）和歸芪益元膏組（18只）。歸芪益元膏組大鼠每日予歸芪益元膏16.4 g/kg灌胃（相當于臨床成人劑量10倍），空白對照組和單純輻射組予等量生理鹽水灌胃。各組給藥體積均為2 mL，連續2周。

2.2 干預

照射前大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉。單純輻射組和歸芪益元膏組大鼠右肺給予2 Gy12C6+離子束單次照射，鉛皮屏蔽身體其余部位，空白對照組予相同方式麻醉，但不予照射。重離子照射在中國科學院近代物理研究所蘭州重離子加速器研究裝置（HIRFL-CSR）的淺層腫瘤治療終端上進行，束流為12C6+離子束。坪區照射，能量為165 MeV，LET為20 keV/μm，吸收劑量率為2 Gy/min，用空氣電離室監測劑量，照射劑量為2 Gy。于照射后6、12、24 h處死各組大鼠6只，腹主動脈取血，部分置于血常規管行全血細胞分析，部分離心取上清液行ELISA檢測。取出左肺、右肺，4%多聚甲醛固定。

2.3 指標檢測

檢測大鼠外周血白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）計數，按ELISA試劑盒說明書檢測并計算大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-1β濃度。4%多聚甲醛固定肺組織，脫水后石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察各組大鼠肺組織形態。

3 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。服從正態分布的計量資料以±表示，采用方差分析，兩兩比較采用法。＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 歸芪益元膏對重離子輻射旁效應損傷大鼠外周血象的影響

與空白對照組比較，照射后12 h單純輻射組大鼠WBC、RBC、PLT、HGB明顯下降（＜0.01）；與單純輻射組12 h比較，歸芪益元膏組12 h大鼠WBC、RBC、PLT、HGB明顯升高（＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠外周血WBC、RBC、PLT、HGB比較（±s）

注：與空白對照組比較，**＜0.01；與單純輻射組12 h比較，##＜0.01

4.2 歸芪益元膏對重離子輻射旁效應損傷大鼠血清轉化生長因子-β1及白細胞介素-6、1β含量的影響

與空白對照組比較，照射后12 h單純輻射組大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-1β含量升高（＜0.01）；與單純輻射組12 h比較，歸芪益元膏組12 h大鼠TGF-β1、IL-6、IL-1β含量降低（＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-6含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白對照組比較，**＜0.01；與單純輻射組12 h比較，##＜0.01

4.3 歸芪益元膏對重離子照射后24 h損傷大鼠肺組織形態的影響

左肺：空白對照組肺泡壁無增厚，無炎性細胞浸潤，肺泡腔內無滲出物，肺泡壁毛細血管無充血、出血；單純輻射組肺泡壁增厚，肺泡腔內有少量滲出物，有少量炎性細胞浸潤；歸芪益元膏組肺泡壁無增厚，肺泡腔內無滲出物，未見炎性細胞浸潤，肺泡壁毛細血管無充血、出血。右肺：空白對照組同左肺；單純輻射組肺泡壁增厚，肺泡腔內有滲出物，有炎性細胞浸潤，肺泡壁毛細血管充血、出血；歸芪益元膏組肺泡壁無增厚，肺泡腔內無滲出物，肺泡壁毛細血管無充血、出血，有少量炎性細胞浸潤。見圖1、圖2。

空白對照組單純輻射組歸芪益元膏組

空白對照組單純輻射組歸芪益元膏組

5 討論

從不斷增加的輻射旁效應的相關報道來看，細胞因子在旁效應中的作用越來越受到重視。細胞因子是一種可溶性的多肽，在炎癥的細胞信號轉導過程中起重要作用，輻射可誘導大量的細胞因子如IL-6、TGF-β1等產生[4]。它們既通過細胞間通訊以旁分泌的形式產生，對鄰近細胞造成影響，也能以自分泌模式影響遠處細胞。因而，在輻射旁效應損傷信號傳遞中發揮重要作用。這些細胞因子及其細胞表面的特殊受體激活相關通路，這些通路反過來誘導細胞內的信號級聯放大，影響靶細胞功能[5]。

TGF-β1參與了輻射相關旁效應的響應，是旁效應的重要中介物，能夠提高旁效應細胞中活性氧和微核數量，TGF-β1的抑制劑能夠降低旁效應損傷[6-7]。有研究表明，輻照后非靶組織中TGF-β1及其受體表達水平明顯升高[8]。TGF-β1還是一種重要的化學趨化因子，可趨化肺泡巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞，合成釋放IL-6等細胞因子，誘導炎癥反應[9]。IL-6是一種多功能的生物活性多肽物質，可誘導以中性粒細胞為主的炎癥細胞在局部聚集，生成活性氧，誘發氧化應激，造成組織炎癥，活化的中性粒細胞又可分泌IL-1β、IL-8等炎癥因子，構成復雜的炎癥網絡調控系統[10]。因此，本實驗以TGF-β1、IL-6、IL-1β作為檢測輻射旁效應的生物學指標。

本實驗結果表明，2 Gy12C6+離子束照射大鼠右肺部后12 h，大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β明顯升高，說明局部輻射誘導了TGF-β1、IL-6、IL-1β的高表達，且其表達存在著時間效應。由此我們分析，機體于照射后12 h逐步啟動自身修復功能，對自身損傷進行修復。這與文獻報道一致[11-13]，旁效應的時間效應因射線種類、劑量等因素而異。

HE染色結果表明，碳離子束照射后24 h，大鼠右肺、左肺病理改變以急性肺泡炎癥為主，提示右肺局部照射后旁組織左肺產生類似的病理損傷，可能是照射后血清中旁效應信號因子TGF-β1、IL-6、IL-1β表達升高，經由血液循環系統引起左肺出現病理改變。

機體的造血系統對輻射最敏感，骨髓是主要的造血組織，電離輻射可以嚴重損傷骨髓的造血功能，導致造血細胞的有絲分裂停止，細胞更新中斷，還可抑制造血免疫功能，發生出血綜合征和感染并發癥。骨髓造血功能受損在外周血象中的反映是各類血細胞數量下降。因此，通過檢測外周血中血細胞的數量可以了解骨髓的造血功能，造血系統的恢復也是輻射損傷防護的基礎環節[14-16]。本實驗結果顯示，大鼠右肺部受2 Gy12C6+離子束照射后12 h，外周血WBC、RBC、PLT、HGB明顯下降，表明局部照射也抑制了骨髓造血細胞的功能。

中醫學雖無輻射及輻射旁效應的相關記載，但射線的致病特點如高能、快速、穿透力強等與中醫毒邪的致病特點極為相似，故中醫學將輻射旁效應急性損傷歸于“毒邪致病”的范疇。毒邪性質酷烈，致病易直中臟腑，敗壞形體，極易耗傷機體氣血陰陽，使機體出現氣血陰陽虧虛的現象[17]。毒邪襲肺，耗氣傷陰血，肺臟氣陰兩虛，肺腎母子相及，病理上相互影響，累及腎中精氣，致腎精不足，氣陰兩虛。腎精為臟腑之氣的根本，腎陰為一身陰氣之本，最終導致機體氣陰兩虛。氣虛無力推動血行，瘀血阻滯，故輻射旁效應損傷的中醫病機以氣陰兩虛為主，兼血虛血瘀。

實驗結果表明，預先灌胃歸芪益元膏，碳離子照射大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β含量較單純輻射12 h大鼠明顯下降，外周血WBC、RBC、PLT、HGB升高，對病理損害有一定的改善作用。表明歸芪益元膏能降低輻射后大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β的表達，推測歸芪益元膏通過抑制TGF-β1的合成，進而減少IL-6、IL-1β的合成釋放，減輕炎癥反應，保護外周血象，從而起到防護輻射旁效應損傷的作用。

綜上所述，歸芪益元膏具有減輕輻射旁效應損傷的作用，其作用機制可能與抑制旁效應信號因子TGF-β1的合成，進而減少IL-6、IL-1β的合成釋放，減輕炎癥反應，保護外周血象有關，但是否通過調控其他靶點而發揮作用，還需進一步研究。

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Study on Protective Effects ofOintment on Rats Damaged Caused by Heavy Ion Radiation Induced Bystander Effects

ZHANG Chao-ning, LI Jin-tian, LIU Yong-qi, LIN Xing-yao, LIXue-yan, SUN Shao-bo, LI Juan, WANGMeng, CHENJi-yao

Objective To discuss the protective effects ofOintment on damages caused by heavy ion radiation induced bystander effects; To explore the possible mechanism. Methods Totally 42 Wistar male rats were randomly divided into blank control group, pure radiation group andOintment group. TheOintment group was givenOintment by gavage for two weeks in advance. Later the right lungs of the rats in the pure radiation group andOintment group were radiated once by 2 Gy12C6+, while the blank control group received no radiation. 6, 12, 24 h after radiation all groups of rats were executed. Peripheral hemogram and the levels of IL-6, TGF-β1 and IL-1β in serum of the rats were examined. The changes of lung tissue pathology morphology in the rats were observed by HE staining. Results Compared with the blank control group, the contents of IL-6, TGF-β1 and IL-1β in serum of the pure radiation group increased obviously at 12 h after radiation (<0.01), and the amount of leukocyte, erythrocyte, blood platelet and hemoglobin distinctly declined at 12 h after radiation (<0.01); HE staining showed that the alveolar wall was thickened at 24 h after radiation, and there were exudate and inflammatory cell infiltration in the alveolar cavity. Compare with the pure radiation group at 12 h after radiation, the levels of IL-6, TGF-β1 and IL-1β inOintment group decreased significantly at 12 h after radiation (<0.01). Indexes of blood routine significantly increased (<0.01), and the pathological changes of lung tissue in rats improved (<0.01).ConclusionOintment can protect damages caused by heavy ion radiation induced bystander effects.

radiation induced bystander effects; heavy ion;Ointment; TGF-β1; IL-6; IL-1β; rats; male

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.011

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0045-04

國家自然科學基金（81460695）

李金田，E-mail：1754648867@qq.com

（2016-11-22）

（2016-12-22；編輯：華強）