籽粒灌漿期高溫對不同耐熱型玉米品種強弱勢粒發(fā)育的影響

張萍，陳冠英，耿鵬，高雅，鄭雷，張沙沙，王璞

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籽粒灌漿期高溫對不同耐熱型玉米品種強弱勢粒發(fā)育的影響

張萍，陳冠英，耿鵬，高雅，鄭雷，張沙沙，王璞

（中國農業(yè)大學農學院/農業(yè)部農作制度重點實驗室，北京 100193）

【目的】灌漿期高溫會對玉米籽粒的生長和發(fā)育造成不利的影響，是影響玉米穩(wěn)產和高產的重要因素之一。比較灌漿期高溫對不同耐熱型玉米品種籽粒形成和生長發(fā)育的影響，以期尋找相應的預防和應對措施，避免和緩解高溫脅迫傷害。【方法】采用玉米籽粒離體培養(yǎng)技術，以耐熱型品種鄭單958和熱敏感型品種德美亞1號為材料，研究了籽粒灌漿期（授粉后17—28 d）高溫對玉米籽粒發(fā)育的影響機制?！窘Y果】高溫加快了兩品種玉米強勢粒前期的灌漿速率，但降低了強、弱勢粒中后期灌漿速率，總體導致灌漿持續(xù)時間縮短，籽粒千粒重下降。在授粉后40 d，鄭單958強、弱勢粒的干重分別比對照低10.58%和18.95%，德美亞1號強、弱勢粒的干重分別比對照低24.78%和28.08%。德美亞1號籽粒干重下降幅度大于鄭單958，且差異顯著。籽粒灌漿期高溫顯著降低了玉米籽粒淀粉合成酶的活性，從而影響兩品種玉米籽粒的淀粉含量。在授粉后40 d，鄭單958強、弱勢粒的淀粉含量較對照分別降低了5.20%和6.46%，德美亞1號強、弱勢粒的淀粉含量較對照分別降低了13.68%和16.39%，均差異顯著。德美亞1號強、弱勢粒淀粉合酶的活性較對照分別降低了19.67%和30.03%，均差異顯著，鄭單958強、弱勢粒的淀粉合成酶的活性分別較對照降低了13.70%和11.26%。高溫處理后，兩種品種玉米籽粒的ABA和IAA含量均上升，ZR含量均下降，而強勢粒的GA3含量均上升，弱勢粒的GA3含量無明顯變化。【結論】籽粒灌漿期高溫對德美亞1號強、弱勢粒發(fā)育的影響均顯著高于鄭單958，對兩品種弱勢粒的影響顯著高于強勢粒。

玉米；離體培養(yǎng)；籽粒灌漿期高溫；強、弱勢粒；淀粉合成酶

0 引言

【研究意義】高溫是近年來影響中國玉米生產的重要因素。華北平原是中國糧食主產區(qū)，因受灌漿期高溫脅迫的制約[1]，該區(qū)春玉米現(xiàn)實產量與理論產量差異極大。玉米灌漿期的最適溫度低于其他生育階段，是對高溫脅迫最敏感的時期之一。灌漿期遭受高溫脅迫會對籽粒的庫容[2]、灌漿速率[3]以及源庫比[4]等產生影響，從而影響產量。因此，開展灌漿期高溫對玉米籽粒發(fā)育影響的研究十分重要。【前人研究進展】已有的研究表明高溫脅迫對玉米籽粒發(fā)育的影響存在品種和粒位的差異。前期研究發(fā)現(xiàn)花前（吐絲前0—8 d）和花后（吐絲后0—8 d）高溫脅迫下耐熱型玉米品種比熱敏感型玉米品種具有較高的葉綠素含量和光合能力，產量和品質受高溫影響較小[5]。Edreira等[6-8]通過研究高溫脅迫對不同品種玉米產量構成因素的影響，發(fā)現(xiàn)吐絲期和灌漿前期高溫脅迫對溫帶玉米種質資源的影響大于熱帶種質資源。此外，高溫脅迫對強、弱勢粒發(fā)育影響的研究發(fā)現(xiàn)，與強勢粒相比，弱勢粒由于庫容限制[9-10]，或同化物供應限制[11-13]，或蔗糖-淀粉代謝途徑中相關酶活性低[14]等原因，籽粒充實程度較差。同時，高溫條件下弱勢粒酶活性下降程度明顯高于強勢粒，從而導致弱勢粒的淀粉含量低于強勢粒[3]。本課題組前期研究結果表明，玉米籽粒對花后前期高溫脅迫的響應存在品種和粒位差異[15]。【本研究切入點】目前研究大多集中在花期或花后前期高溫脅迫對玉米籽粒發(fā)育的影響方面，對于籽粒灌漿期（授粉后17—28 d）高溫脅迫下籽粒發(fā)育的影響還相對較少。且籽粒灌漿期高溫脅迫對不同耐熱型品種、不同粒位籽粒發(fā)育的影響及其機理尚不明確，需要進一步研究?！緮M解決的關鍵問題】基于前期研究的基礎上，本試驗采用籽粒離體培養(yǎng)技術，選用耐熱型品種鄭單958和熱敏感型品種德美亞1號為材料，旨在探明籽粒灌漿期（授粉后17—28 d）高溫對不同耐熱型品種玉米強弱勢粒生長發(fā)育的影響及其機制，為生產中制定有效的防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

選用鄭單958（耐高溫）和德美亞1號（熱敏感）為材料，種植于中國農業(yè)大學上莊實驗站，田間管理同常規(guī)大田。在玉米吐絲前選穗進行套袋處理，人工統(tǒng)一授粉。在授粉后3 d取穗進行離體培養(yǎng)。兩個品種均分別切取強勢粒和弱勢粒，從頂部向下1 cm為弱勢粒，從基部向上第18—20位籽粒為強勢粒。授粉后第4天在25℃/25℃（12 h/12 h）下暗培養(yǎng)一天，第5天開始處理，高溫處理時間為授粉后17—28 d，高溫處理溫度為35℃/25℃（12 h/12 h），授粉后第28天轉入25℃/25℃培養(yǎng)至成熟。對照處理溫度為25℃/25℃。

1.2 籽粒離體培養(yǎng)方法

參考Gengenbach等[16]方法，果穗經(jīng)75%酒精滅菌后放入超凈臺進行操作，按籽粒穗軸比為1﹕9切取樣穗。固體培養(yǎng)基配置方法參照趙麗曉等[3]。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 籽粒干重 在授粉后10、20、30和40 d取樣，測籽粒鮮重，105℃殺青 30 min，80℃烘干，測籽粒干重。

1.3.2 籽粒淀粉含量 取授粉后28 d和40 d的籽粒， 105℃殺青30 min，80℃烘干，研磨后參照何照范[17]的方法測定淀粉和可溶性糖含量。

1.3.3 淀粉合成相關酶活性 在授粉后28 d，取鮮籽粒液氮冷凍后置超低溫冰箱中，用于ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、蔗糖轉化酶、蔗糖合成酶活性的測定，酶的提取和測定參照Nakamura等[18]和Zinselmeier等[19]的方法，稍作改進。

提取液為：50 mmol·L-1Hepes，2 mmol·L-1MgCl2.6H2O，3%（V/V）乙二醇，1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1EDTA-2Na，1 mol·L-1NaCl。

ADPG焦磷酸化酶反應體系：50 mmol·L-1Hepes- NaOH（pH 7.2） 100 μL，10 mmol·L-1MgCl2.6H2O 50 μL，15 mmol·L-1DTT 100 μL，1.5 mmol·L-1ADPG 100 μL，20 mmol·L-1PPiNa 100 μL，粗酶液200 μL。

淀粉合成酶反應體系：50 mmol·L-1Hepes- NaOH（pH7.2）50 μL，15 mmol·L-1DTT 50 μL，1.5 mmol·L-1ADPG 50 μL，1 mg支鏈淀粉100 μL，粗酶液200 μL。

蔗糖轉化酶反應體系：乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.8）200 μL，100 mmol·L-1蔗糖200 μL，粗酶液100 μL。

蔗糖合成酶反應體系：50 mmol·L-1Hepes-NaOH（pH7.2）100 μL，10 mmol·L-1UDP100 μL，10 mmol·L-1MgCl2.6H2O 50 μL，100 mmol·L-1蔗糖150 μL，粗酶液100 μL。

1.3.4 激素含量 在授粉后28 d取鮮籽粒液氮冷凍后置超低溫冰箱中，用于GA3、ZR、IAA、ABA 4種激素含量測定。具體方法如下：稱取0.2 g鮮籽粒，加4 mL樣品提取液（80%甲醇，內含1 mmol·L-1BHT），在冰浴下研磨成勻漿，搖勻后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4 h，1 000×離心15 min，取上清液。沉淀中加1 mL提取液，攪勻，置4℃下再提取1 h，離心，合并上清液并記錄體積。上清液過C-18固相萃取柱。將過柱后的樣品用氮氣吹干，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容（一般0.5 g鮮重用1.5—3.0 mL左右樣品稀釋液定容）。樣品按照包被、洗板、競爭、洗板、加二抗、洗板、加底物顯色、比色的順序測定各激素的含量。具體操作步驟參照宋松泉等[20]的酶聯(lián)免疫法，酶聯(lián)免疫試劑盒由中國農業(yè)大學提供。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理，SPSS 20.0軟件 進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗法進行多重比較及差異顯著性分析，文中圖表數(shù)據(jù)均為3次或3次以上重復的平均值。

2 結果

2.1 籽粒灌漿期高溫對籽粒灌漿動態(tài)及灌漿速率的影響

籽粒灌漿期高溫顯著降低了兩品種玉米籽粒成熟期的粒重，對德美亞1號的影響大于鄭單958（圖1）。在40 DAP，德美亞1號強、弱勢籽粒的粒重較對照處理顯著降低了24.78%和28.08%，鄭單958強、弱勢籽粒的粒重顯著降低了10.5%和18.59%。高溫導致兩品種弱勢粒粒重的降幅高于強勢粒。

兩品種玉米籽粒的灌漿速率呈先升高后降低的趨勢（圖2）。常溫處理下，兩品種強、弱勢粒灌漿速率在30 DAP達最大。庫容充實期高溫處理加快了兩品種強勢粒10—20 DAP的灌漿速率，與籽粒粒重變化同步（圖1），但降低了兩品種強、弱勢粒灌漿中后期的速率。高溫處理后兩品種強、弱勢粒的灌漿速率在20 DAP達到峰值，較對照均有不同程度的提前。中后期灌漿速率的降低，灌漿持續(xù)時間的縮短，是導致籽粒干重下降的主要原因。

2.2 籽粒灌漿期高溫對玉米籽粒灌漿參數(shù)的影響

表1中各參數(shù)表明，籽粒灌漿期高溫處理后，鄭單958強勢粒的Gmax和Gmean值明顯升高，D和t3值明顯減小。與鄭單958強勢粒不同的是，鄭單958弱勢粒和德美亞1號強、弱勢粒的上述參數(shù)均呈減小趨勢。其中，德美亞1號Gmax和Gmean值下降幅度大于鄭單958。這些結果表明，高溫處理對灌漿參數(shù)的影響存在粒位和品種差異。

2.3 籽粒灌漿期高溫對玉米籽粒淀粉含量的影響

籽粒灌漿期高溫處理對兩品種玉米籽粒的淀粉含量存在不同程度影響（圖 3）。與對照相比，鄭單958強弱勢粒淀粉含量在28 DAP和40 DAP均無顯著變化。在28 DAP，德美亞1號強、弱勢粒的淀粉含量分別降低了6.73%和9.92%。在40 DAP，德美亞1號強、弱勢粒的淀粉含量分別顯著降低了13.68%和16.39%。以上結果表明，高溫對德美亞1號強、弱勢粒淀粉含量的影響顯著高于鄭單958。

表1 籽粒灌漿模型與籽粒灌漿參數(shù)

HT：高溫處理；CK：對照。根據(jù) Duncan檢驗*表示在 0.05 水平上差異顯著，ns 表示在0.05 水平上差異不顯著。下同

圖2 籽粒灌漿期高溫下不同品種玉米籽粒灌漿速率的變化

根據(jù) Duncan檢驗不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著。下同

2.4 籽粒灌漿期高溫對玉米籽粒淀粉合成相關酶活性的影響

籽粒灌漿期高溫處理后，鄭單958強、弱勢粒和德美亞1號弱勢粒的蔗糖合成酶、蔗糖轉化酶和ADPG焦磷酸化酶活性的變化趨勢一致，均顯著小于相應對照。而德美亞1號強勢粒上述3種酶的活性均顯著高于對照。

高溫處理后，兩品種強、弱勢籽粒淀粉合成酶活性均小于對照。鄭單958強、弱勢粒淀粉合成酶的活性分別降低了13.70%和11.26%，德美亞1號強、弱勢粒的淀粉合酶的活性分別降低了19.67%和30.03%。德美亞1號淀粉合成酶活性下降的幅度大于鄭單958（圖4）。

2.5 籽粒灌漿期高溫對玉米籽粒激素含量的影響

從表2可以看出，兩品種玉米弱勢粒的ZR含量 均高于強勢粒，這可能是由強、弱勢粒發(fā)育差異引起的。高溫處理后，鄭單958和德美亞1號強勢粒的GA3含量分別顯著升高了9.56%和25.29%，而弱勢粒無明顯變化。兩品種玉米強、弱勢粒ZR、IAA和ABA含量的變化趨勢一致，均表現(xiàn)為ZR降低，IAA和ABA上升。鄭單958強、弱勢粒ZR含量相比于對照降低了32.88%和16.10%，IAA分別升高了29.44%、27.29%；德美亞1號強、弱勢粒ZR含量相比于對照降低了19.2%和31.95%，IAA分別升高了75.52%、58.06%。可見，高溫對籽粒的影響不是由單一的某種激素引起的，而是由多種激素共同作用的結果。

3 討論

籽粒灌漿包括灌漿速率和灌漿持續(xù)時間兩方面，維持較高的灌漿速率和較長的灌漿持續(xù)時間有利于籽粒干重的積累。前期有些研究表明籽粒灌漿期長期高溫會顯著縮短籽粒的灌漿持續(xù)時間，而灌漿速率僅有略微的上升[21]。有些研究則表明籽粒灌漿期高溫會延長籽粒的灌漿時間，顯著降低籽粒的灌漿速率，但是灌漿時間的延長不能彌補灌漿速率下降引起的干重損失[22]。本研究表明高溫處理加快了兩品種玉米強勢粒前期的灌漿速率，但降低了強、弱勢粒灌漿中后期的速率，且灌漿持續(xù)時間縮短，最終導致粒重下降，這與趙麗曉等[3]的研究結果一致。此外，高溫處理后，德美亞1號強、弱勢粒的最大灌漿速率和平均灌漿速率的下降幅度均大于鄭單958。籽粒灌漿期高溫對熱敏感品種灌漿速率的影響更顯著。

圖4 籽粒灌漿期高溫處理對玉米籽粒淀粉合成相關酶活性的影響

表2 籽粒灌漿期高溫處理下玉米籽粒激素含量的影響

表中數(shù)值為 3 次重復均值±。根據(jù)Duncan檢驗不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著

Values are the average of three replicates, reported as mean ±. Bars with different letters are significantly different at＜0.05 based on the Duncan test

本研究表明，兩品種強、弱勢粒淀粉合成酶的活性均下降，且對德美亞1號和弱勢粒的影響更為顯著。高溫影響淀粉合成酶的活性從而影響淀粉的積累。相較于鄭單958和強勢粒，德美亞1號和弱勢粒本身所含淀粉合成酶的活性低，因此受高溫影響更顯著。很多報道指出高溫會降低酶的活性從而抑制淀粉的積累[23-27]。但是關于淀粉合成過程中的限制性酶尚無定論。本課題組前期研究結果表明花后前期高溫影響了籽粒灌漿后期的ADPG焦磷酸化酶和淀粉合酶，使其活性顯著降低，影響籽粒淀粉合成[3]。Wilhelm等[21]等指出AGPase和淀粉合成酶對高溫都十分敏感，但是只有AGPase的活性用溫度系數(shù)調整后仍呈現(xiàn)下降的趨勢。Ebrahim等[28]和趙福成等[29]研究指出高溫降低蔗糖代謝酶的活性，從而降低蔗糖和淀粉的含量。有很多研究則表明高溫對淀粉合成的影響至少有一部分是作用在淀粉合成酶的活性上[23, 30-31]。Hurkman等[32]通過對小麥的基因表達分析，發(fā)現(xiàn)高溫會使淀粉合成酶的轉錄子顯著減少。李木英等[14]也研究發(fā)現(xiàn)高溫處理后，早稻籽粒發(fā)育后期中的淀粉合成酶活性降低。此外，籽粒灌漿期高溫處理后，鄭單958強、弱勢粒和德美亞1號弱勢粒的蔗糖合成酶、蔗糖轉化酶和ADPG焦磷酸化酶的活性均顯著下降。而德美亞1號強勢粒的上述3種酶的活性均顯著上升。這可能是由于品種和發(fā)育差異引起的，有待進一步研究。

植物激素在作物對環(huán)境脅迫的適應性和耐性上起了極為重要的作用。在高溫脅迫下，激素的動態(tài)平衡、穩(wěn)定性、含量、生物合成及分布都會發(fā)生變化[33]。本研究表明，高溫處理后，兩種品種玉米強勢粒的GA3含量均高于對照，而弱勢粒的GA3含量與對照基本保持一致。GA3參與同化物的轉運，在籽粒灌漿充實的過程中起重要作用[34]。強勢粒GA3含量的增加有利于同化物向籽粒運輸。高溫處理后，兩品種玉米籽粒的ABA含量顯著高于對照。ABA主要通過提高籽粒中淀粉合成酶、酸性轉化酶的活性從而提高籽粒對蔗糖的卸載和轉運能力。有研究指出高溫脅迫會導致ABA含量的上升，ABA含量的上升可以誘導熱激蛋白家族（HSPs）的表達[35]。Musatenko等[36]對玉米耐熱性的研究發(fā)現(xiàn)，玉米秧苗在受脅迫后ABA的含量也會迅速上升。徐云姬等[37]在溫室試驗條件下，發(fā)現(xiàn)一些觀察點的ABA含量很高，說明在高溫、干旱等不利環(huán)境條件下ABA含量的會增加。本試驗研究結果與前人研究結果一致。此外，本研究表明兩品種玉米籽粒的ZR含量顯著降低，而IAA含量顯著上升。ZR對胚乳細胞的增殖起重要的調控作用，很多研究表明，高溫處理后，玉米籽粒中的ZR和IAA含量均明顯降低[3, 38-40]。IAA含量的變化與前人研究結果不同，可能與高溫處理時間不同有關，有待進一步深入研究。

4 結論

高溫處理加快了兩品種玉米強勢粒前期的灌漿速率，但降低了強、弱勢粒中后期灌漿的速率，且灌漿持續(xù)時間縮短，最終導致籽粒粒重下降。并且，高溫對德美亞1號強、弱勢粒的影響顯著高于鄭單958。高溫降低了兩種品種玉米籽粒淀粉合成酶的活性，從而降低了兩品種玉米籽粒的淀粉含量，德美亞1號強、弱勢粒淀粉含量的下降幅度大于鄭單958。高溫處理后，兩品種玉米強、弱勢粒ZR、IAA和ABA含量的變化趨勢一致，均表現(xiàn)為ZR降低，IAA和ABA上升，而強勢粒的GA3含量均上升，弱勢粒的GA3含量無明顯變化。

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（責任編輯 楊鑫浩）

Effects of High Temperature During Grain Filling Period on Superior and Inferior Kernels’ Development of Different Heat Sensitive Maize Varieties

ZHANG Ping, CHEN Guanying, GENG Peng, GAO Ya, ZHENG Lei, ZHANG Shasha, WANG Pu

(College of Agronomy & Biotechnology, China Agricultural University/Key Laboratory of Farming System, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】High temperature during grain filling period is likely to cause large negative impacts on maize kernel growth and development, which is one of the important factors affecting high and stable yield of maize. To avoid and relieve the damage of high temperature and to find out the effective methods, this study compared the effects of high temperature during grain filling period on kernel formation and development of maize varieties with contrasting heat sensitivities.【Method】The temperature non-sensitive variety (Zhengdan958) and temperature sensitive variety (Demeiya1) were used in vitro culture system to investigate the influence of high temperature on maize kernel development during grain filling period (17-28 days after pollination, DAP).【Result】High temperature accelerated grain filling rate at early stage for both varieties, but decelerated grain filling rate at late stage for both varieties. As a result, the duration was shortened for grain filling and thousand kernel weight was decreased. At 40 DAP, the dry weight of Zhengdan 958 superior and inferior kernels were reduced by 10.50% and 18.95%, the dry weight of Demaya 1 superior and inferior kernels were respectively reduced by 24.78% and 28.08%. Moreover, starch synthesis was influenced by reducing the activity starch synthase under high temperature. The degree of the reduction of Demaya 1 superior and inferior kernels is significantly higher than Zhengdan 958. At 40 DAP, the starch content of Zhengdan 958 superior and inferior kernels were respectively lower 5.20% and 6.46% than the controls, the starch content of Demeiya 1 superior and inferior kernels were lower 13.68% and 16.39% than the controls. The starch synthase activities of superior and inferior kernels of Demaya 1 were reduced by 19.67% and 30.03%, respectively. The starch synthase activity of Zhengdan 958 of superior and inferior kernels was reduced by 13.70% and 11.26%, respectively. The ABA and IAA content in maize kernels of both varieties with high temperature treatment increased significantly while the ZR content decreased, and the GA3content in superior kernels of both varieties increased while the GA3content in inferior kernels of both varieties didn’t change significantly.【Conclusion】It was found that the effects of high temperature during grain filling period were more serious on grain development of Demaya 1 than Zhengdan 958, and had more effects on the inferior kernels than superior kernels of both varieties.

maize; in vitro culture; high temperature during grain filling; superior and inferior kernels; starch synthase

2016-08-26；

2017-03-10

國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201203031）

王璞，E-mail：wangpu@cau.edu.cn

聯(lián)系方式：張萍，E-mail：648872767@qq.com。