兩株煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定和促生防病潛力評價

徐同偉，周建云，祖慶學，文錦濤，簡勝義，胡 勇，刁朝強，曾慶賓，陳德鑫

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266100；2.貴州省煙草公司貴陽市公司，貴陽 550000；3.中國農業科學院研究生院，北京 100000；4.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617026）

兩株煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定和促生防病潛力評價

徐同偉1,3，周建云2，祖慶學2，文錦濤2，簡勝義2，胡 勇2，刁朝強2，曾慶賓4，陳德鑫1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266100；2.貴州省煙草公司貴陽市公司，貴陽 550000；3.中國農業科學院研究生院，北京 100000；4.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617026）

煙草黑脛病在我國煙區分布廣泛，嚴重影響煙草的產量和質量。篩選出對煙草具有防病和促生作用的細菌是有效控制煙草黑脛病危害和提高煙草產量的重要途徑。通過稀釋涂布平板法、對峙培養法從煙草病株根際土壤中篩選出YBM-4和YJC-4兩株細菌。根據分子形態學、最適生長條件和生理生化及16S rDNA基因序列分析比對結果，鑒定YBM-4是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），YJC-4是沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）。在對峙培養中，YBM-4和YJC-4細菌對煙草黑脛病菌絲的相對抑制率分別是85.34%和72.99%。在盆栽試驗中，YBM-4和YJC-4對煙株生物量和農藝性狀的促生作用明顯，YBM-4、YJC-4和YBM-4+YJC-4混劑（比例1：1）對煙草黑脛病的平均防治效果分別是76.37%、80.06%和81.50%，病程進展曲線下面積（AUDPC）分別比對照降低265.01，281.58，287.32。表明細菌YBM-4和YJC-4具有潛在的利用和開發價值。

細菌；煙草黑脛?。晦卓梗淮偕?；生防潛力

病蟲害是制約煙草產業可持續發展的重要因素，每年造成巨大的經濟損失[1]。煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）是一種兼性寄生菌，喜高溫高濕，主要危害煙株根部和莖基部，導致煙葉減產、品質降低，具有毀滅性危害[2]。目前對于該病的防控主要采用化學農藥、抗病品種及一些栽培措施，但都有其缺陷性和局限性。采用拮抗菌也可以有效控制該病的危害[3-4]，而且具有無污染、適應性強的特點，開發和利用潛力巨大，符合煙草根莖病害控制的發展方向。

芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，研究發現一些芽孢桿菌作為拮抗菌對煙草黑脛病具有良好的防治效果[5-6]，作為促生細菌（PGPR）對煙株的產量有明顯的提高作用[7-10]。其中枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[11]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[12]和短小芽孢桿菌（B. pumilus）[13]等利用抗生、溶菌、競爭、重寄生作用抑制病原菌對植物的侵染和危害。短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）[14]和多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[15]等通過改善煙株根際環境、平衡植物激素水平來促進煙葉的生長和發育。近些年拮抗菌的研究熱度不減，但是針對煙草，既有抗病效果又有促生作用的研究較少，推廣應用更是不足。

本研究從黑脛病病株的根際土壤中篩選出12株對黑脛病菌有較好防治效果的細菌。根據分子形態學、生理生化特性、基于16S rDNA序列構建的系統發育樹，明確了生防效果最好的菌株YBM-4和YJC-4的系統分類地位，利用對峙培養和盆栽試驗探究了兩株細菌的生防和促生效果，以期為菌株的進一步開發利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試煙草品種為紅花大金元（易感品種），煙草黑脛病菌為0號小種，均由國家煙草改良中心提供。2015年7月從貴陽、攀枝花、西昌、濰坊、臨沂、青島等6煙區采集土壤87份，選取5～10 cm深處的黑脛病株根際土壤。其中YBM-4篩選自四川攀枝花煙區，YJC-4篩選自貴州貴陽修文煙區。

拮抗菌的培養和分離用NA和NB培養基；抑菌活性測定用燕麥培養基；生理生化性狀測定用運動型培養基、檸檬酸鹽瓊脂培養基和葡萄糖肉湯培養基；Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術有限公司），革蘭氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑（江蘇靈寶化學有限公司），枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（黑龍江德強生物股份有限公司）。

1.2試驗設計

1.2.1 菌株的篩選和分離 參照Niemann的稀釋涂布平板法[16]，待測土壤除雜過篩后，稱取5 g，加到100 mL錐形瓶中，用無菌水定容至50 mL，在恒溫振蕩培養箱中，28 ℃，200 r/min震蕩1 h，使待測土樣充分稀釋均勻，靜止沉淀后，取上清液1 mL梯度稀釋至10-1～10-6倍，吸取各梯度溶液200 μL。用滅菌的涂布器均勻涂布在NA培養基上，37 ℃恒溫培養48 h，空白對照用無菌水，3次重復。挑取生長性狀不同的單菌落，多次平板培養和純化，直到獲得純化的單菌落，甘油保存。

1.2.2 抑菌活性測定 采用對峙培養法[17]，用直徑5 mm的打孔器將煙草黑脛病菌接種到OA培養基的中點，在菌塊離中心20 mm處對稱兩側接種8 μL拮抗菌液（約1.0×106cfu/mL），倒置，在28 ℃恒溫培養5 d，觀察黑脛病菌周圍有無抑菌帶，并測量其抑菌直徑大小d（mm），對照接種等量無菌水，其他均相同。相對抑菌率（%）=[(對照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑]×100%。

1.2.3 分子形態學鑒定 （1）取樣，將細菌分別接種到NB培養基中，28 ℃，120 r/min震蕩培養48 h，取足量菌液3000 r/min離心。（2）固定：用2.5%的戊二醛和2%鋨酸固定。（3）脫水處理：用乙醇的PBS溶液按30%，50%，70%，90%濃度梯度處理樣品，后經100%乙醇和叔丁醇脫水處理。（4）冷凍干燥。（5）噴施Pt粉后，在電鏡下觀察YJC-4和YBM-4兩種菌的分子形態結構。

1.2.4 生理生化特性鑒定 參照《植病研究方法》[18]，利用革蘭氏染色法檢驗細菌陽性/陰性，穿刺法檢測運動性和明膠液化情況，1.5%二甲基對苯撐二胺檢測細菌中的氧化酶，溴百里酚藍（1.5%酒精溶液）檢測檸檬酸鹽，格里斯（Griess-llosvary）試劑法檢測硝酸鹽和N2，V-P試驗檢驗細菌的陽性/陰性，甲基紅試驗檢測糖代謝產酸的變化，溴百里酚藍檢測葡萄糖、果聚糖、淀粉的分解狀況，觀察7%氯化鈉溶液中拮抗菌的生長狀況。

1.2.5 分子生物學鑒定 （1）根據DNA提取試劑盒的步驟，取過夜培養的拮抗菌1 mL，經過細胞裂解、除雜和洗脫后，-20 ℃保存；（2）以799F(5'-AA CAGGATTAGATACCCTG-3')和R1492 (5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3')為引物擴增菌株16S rDNA；（3）50 μL擴增體系：Template 1 μL，Reverse primer 1 μL，Forward primer 1 μL，2×Easy Tap?PCR Super Mix 25 μL，ddH2O 22 μL；（4）PCR反應體系：94 ℃，5 min；94 ℃，30 sec；55 ℃，30 sec；72 ℃，1 min；35個循環；72 ℃，10 min。（5）PCR產物序列測定后，利用BLAST軟件進行同源性比較，用MEGA5.1的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.2.6 促生盆栽試驗 當紅花大金元煙苗生長到5～6片葉時，取出后清水沖凈，分別在兩種拮抗菌液（約1.0×106cfu/mL）中浸根，30 min后取出并移栽到花盆中（上口徑100 mm×高90 mm）。移栽后緩苗3 d，用同濃度的菌液對煙株灌根處理，10 mL/株，每次重復20株，3次重復，空白用等量的清水處理。在28 ℃，80%濕度的人工氣候室中培養并觀察。移栽后45 d，每個重復選取具有代表性的5株，測量整株鮮質量、干質量，根鮮質量、干質量，平均株高，平均根長，最大葉長，最大葉寬，分析拮抗菌對煙株生長量、農藝性狀的促生效果。

1.2.7 盆栽試驗防效 將配制好的兩種菌液（約1.0×106cfu/mL）分成3個處理，處理1是YJC-4菌液、處理2是YBM-4菌液、處理3是YJC-4和 YBM-4菌液按體積比1∶1混合，分別對生長在盛有滅菌土壤的花盆（上口徑100 mm×高90 mm）中的紅花大金元煙苗（5～6片葉）灌根處理，同時接種黑脛病菌，每隔7 d，菌液灌根1次，共3次，用58%甲霜·錳鋅和枯草芽孢桿菌作為對照，500倍液，對照用等量的無菌水，其他處理措施均相同。每個處理18株，3次重復。在第3次施藥后7 d和 14 d調查發病率（%）、病情指數，相對防治效果（%）和病程進展曲線下面積（AUDPC）。分級標準嚴格按照中華人民共和國煙草行業標準（YC/T39—1996）規定執行。計算公式：病程進展曲線下面積（AUDPC）=∑[(Ai+Bi-1)/2](Ti-Ti-1)，Ai和Bi-1表示病情指數，Ti和Ti-1表示兩次調查結果的時間差[19]。

1.2.8 數據處理 采用DPS軟件，Duncan新復極差法進行多重比較。

2 結 果

2.1拮抗菌的平板抑菌效果

圖1可知，通過對峙培養法，YBM-4細菌對煙草黑脛病抑菌效果最明顯，產生清晰的抑菌圈，菌絲稀疏，邊緣受到抑制和溶解，最大抑菌直徑是74.25 mm，相對抑制率為85.34%。其次為YJC-4，菌絲生長稀疏不均勻，最大抑菌直徑是63.50 mm，相對抑制率72.99%，具有較好的抑菌效果。（其中A：對照組菌落直徑d1=87.00 mm；B：YBM-4菌落直徑d2=12.75 mm；C：YJC-4菌落直徑d3=23.50 mm）。

2.2分子形態學鑒定

如圖2所示，在掃描電子顯微鏡6×104倍下觀察，YBM-4拮抗菌為橢圓柱狀，內生芽孢，兩頭寬中間略窄，表面粗糙，灰暗不透明，大小為a1（0.38～0.66 μm）×b1（1.27～1.58 μm），YJC-4拮抗菌為圓柱狀，內生芽孢，表面附有黏液，灰白色，大小為a2（0.31～0.47 μm）×b2（1.30～1.78 μm）。其中D為YBM-4，E為YJC-4拮抗菌。

圖1拮抗菌YBM-4和YJC-4對煙草黑脛病菌的抑制作用Fig. 1 Inhibiting effects of stains YBM-4 and YJC-4 onPhytophthora nicotianae

2.3生理生化特性鑒定

如表1所示，YBM-4菌為革蘭氏陽性菌，具有一定運動性，在V-P測驗、甲基紅試驗顯陽性，氧化酶、明膠液化呈陰性，可以利用檸檬酸鹽和水解淀粉，在硝酸鹽培養液中產生亞硝酸鹽和N2，能夠分解葡萄糖，不分解果聚糖，在7%氯化鈉中生長良好。YJC-4菌為革蘭氏陽性菌，具有運動性，在氧化酶、V-P試驗和甲基紅中顯陽性，明膠液化顯陰性，可以利用檸檬酸鹽，不能水解淀粉，產生大量的亞硝酸鹽和N2，分解葡萄糖、果聚糖，可以在7%氯化鈉中正常生長。

2.4分子生物學鑒定

如圖3所示，YBM-4和YJC-4菌的16S rDNA序列長度分別為635 bp、670 bp，將這兩株菌的16S rDNA序列通過BLAST程序對比分析，YBM-4與枯草芽孢桿菌B. subtilis（KT985478.1）進化關系最近，同源性達99%，YJC-4與沙福芽孢桿菌B. safensis（JF411315.1）進化關系最近，同源性99%。根據分子形態學、生理生化特性和16SrDNA序列同源性分析，YBM-4鑒定為枯草芽孢桿菌，登錄號為KX663829，YJC-4為沙福芽孢桿菌，登錄號為KX663830。

表1 YBM-4和YJC-4兩種菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of YBM-4 and YJC-4

2.5促生作用

2.5.1 兩種拮抗菌對煙苗生物量的促生作用 如表2所示，移栽后45 d，2株細菌對煙株的整株鮮質量，整株干質量、根鮮質量、根干質量的促進作用明顯。其中YBM-4細菌對干質量、根干質量的促進作用最明顯，比對照分別增加59.93%、79.08%，莖部粗壯，葉色濃綠。YJC-4細菌處理的煙株促生作用也較好，整株鮮質量和干質量比對照分別增加48.66%和50%，根部鮮質量和根干質量分別增加31.62%和62.09%，根系比對照更濃密。YJC-4菌的整體促進效果略差于YBM-4，但差異不顯著，與對照差異極顯著，表明2株細菌可以有效促進側根形成，煙苗的生長和物質的積累。

2.5.2 兩種拮抗菌對煙株農藝性狀的促生作用如表3所示，移栽后45 d，2株細菌對煙苗的株高、根長、最大葉長和最大葉寬的促進作用明顯。其中YBM-4細菌對根長和株高的促進作用最明顯，特別是促進主根系的生長，與對照相比，增長率分別是28.53%和12.41%，略高于YJC-4處理的煙苗2.94%和0.89%，兩者差異不顯著，與對照相比差異極顯著。YBM-4細菌促進煙苗的葉長、葉寬增加6.85%和4.84%，略低于YJC-4處理的煙苗2.94%和0.89%，之間差異不顯著，與對照相比差異顯著。表明2株細菌可以有效促進煙苗的株高和主根系的伸長，增加葉片表面積。

圖3拮抗菌YBM-4和YJC-4的16SrDNA序列系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strains YBM-4 and YJC-4 based on 16SrRNA gene sequence

表2拮抗菌對煙株生物量的促生作用Table 2 Antagonistic strains of tobacco biomass growth promoting effect

表3拮抗菌對煙株農藝性狀的促生作用Table 3 Antagonistic bacteria on Agronomic Characters of tobacco plant growth promoting effect

2.6盆栽試驗

如表4所示，施藥后第7天調查表明，YBM-4、YJC-4和YBM-4+YJC-4混劑（比例1：1）與CK相比，防效分別為79.70%、81.17%和82.03%，與對照差異極顯著。甲霜·錳鋅處理的煙苗防效為84.67%，略好于3類細菌菌液，但差異性不顯著，5組處理與對照相比差異性均顯著。表明短時間內，5組處理對煙草黑脛病的防治效果均明顯。第14天的調查表明，YBM-4+YJC-4混劑的防治效果最好，為80.97%，與甲霜·錳鋅防治效果相當，差異不顯著，其次為YJC-4和YBM-4，防效分別為78.94%和73.03%。甲霜·錳鋅的病程進展曲線下面積比對照低288.78，表明甲霜·錳鋅可有效推遲黑脛病的發生，有效緩解病情的加重和蔓延。其次為YBM-4+YJC-4混劑，比對照低287.32，兩者差異不顯著，枯草芽孢桿菌AUDPC最大，效果最差。綜上所述，YBM-4+YJC-4混劑的防效明顯，兩種細菌混合后，相互作用，可有效增強對煙草黑脛病的防治效果，延緩和推遲病害的發生和擴散。

表4拮抗菌對煙草黑脛病的病程進展曲線下面積和盆栽試驗防治效果Table 4 Control efficacy and AUDPC of strain YBM-4andYJC-4 on tobacco black shank in greenhouse

3 討 論

枯草芽孢桿菌（B. subtilis）作為植物根際細菌，對煙苗的促進作用已有報道。易有金等[20]發現枯草芽孢桿菌B-001可有效定殖在根莖部，從而增加煙草幼苗根長、株高、葉長、葉寬和鮮質量。本試驗研究表明，枯草芽孢桿菌YBM-4通過浸根、灌根2種方式侵入到煙苗根部周圍，提高煙株根部的微生物活性，豐富菌群結構[21]。接種YBM-4細菌45 d后，與對照相比煙苗的根系發達、莖稈粗壯，有利于營養物質和所需礦質元素的吸收，從而提高煙葉的產量和品質。沙福芽孢桿菌此方面的研究鮮有報道，沙福芽孢桿菌YJC-4與枯草芽孢桿菌YBM-4相比，促進葉長葉寬、增加葉片表面積效果更好，但差異性不顯著。YJC-4細菌應用潛力較大，具有深入研究的必要性。

與植物相關的芽孢桿菌，分為植物病原菌、生防菌和腐生菌三類。王進等[11]發現枯草芽孢桿菌21b對煙草黑脛病菌的抑制率達78.33%。本試驗2次調查結果表明，在施藥后第7 d，YJC-4和YBM-4作為單菌劑，YBM-4+YJC-4作為混合菌劑，甲霜·錳鋅作為化學藥劑，均可有效控制煙草黑脛病的發生和蔓延。施藥后第14 d，防效均有所減弱，特別是枯草芽孢桿菌菌劑效果最差，防效只有65.31%。但YBM-4+YJC-4混合菌劑的防治效果較好，為80.97%，AUDPC比對照降低287.32，表明兩種拮抗菌及其混劑的防效可在長時間內發揮作用，延緩黑脛病的發生和擴展，且防治作用明顯。但是由于受復雜環境的影響，氣候、雨水、溫度等對拮抗菌的生長和定殖能力都會造成各種阻礙，因此，拮抗菌的大田應用效果需要進一步驗證。

4 結 論

拮抗菌的應用和發展是生物防治的一種重要手段和方法，其中芽孢桿菌具有分布廣、抵抗力強等特點。本研究篩選的兩株芽孢桿菌，YJC-4和YBM-4能有效防治煙草黑脛病，促進煙苗的生長與發育等優點，效果持久，具有潛在的研究和應用價值，為煙草黑脛病的生物防治提供了新的資源。

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Screening, Identification, Biocontrol and Growth-promoting Potential Evaluation of Two Bacterial Strains against Tobacco Black Shank

XU Tongwei1,3, ZHOU Jianyun2, ZU Qingxue2, WEN Jintao2, JIAN Shengyi2, HU Yong2, DIAO Chaoqiang2, ZENG Qingbin4, CHEN Dexin1*
(1. Tobacco Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266100, China; 2. Guiyang Tobacco Company, Guiyang 550001, China; 3. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 4. Panzhihua Branch of Sichuan Tobacco Company, Panzhihua, Sichuan 617026, China)

Tobacco black shank is widely distributed in tobacco growing areas in China and has serious effects on tobacco production and quality. One of the potential control approaches against tobacco black shank is to use antagonistic bacterial. Using the culture plate dilution method, YBM-4 and YJC-4, two bacterial strains were isolated from tobacco rhizosphere soil to have an antagonistic effect on tobacco black shank. Based on comprehensive analysis on morphology, biological traits and physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA gene sequence analysis, YBM-4 was identified asBacillus subtilisand YJC-4 was identified asBacillus safensis. The two strains of YJC-4 and YBM-4 had significant antagonism against tobacco black shank. In paired cultures, relative inhibition rate of YJC-4 and YBM-4 reached 85.34% and 72.99%. In the pot experiment, effects of YBM-4 and YJC-4 on tobacco agronomic traits and biomass growth promoting were obvious. The control effects on tobacco black shank of YBM-4, YJC-4 and YBM-4+YJC-4 mixture (1：1 ratio) were 76.37%, 80.06% and 81.50%, with the AUDPC lower than that of the control group by 265.01, 281.58, and 287.32 respectively. YBM-4 and YJC-4 have a potential in bio-control of tobacco black shank.

bacteria; tobacco black shank; antagonism; growth; biocontrol potential

S435.72

1007-5119（2017）03-0044-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.008

貴州省煙草公司貴陽市公司重大專項“貴陽煙草主要病蟲草綠色防控技術集成示范與推廣”（201602）；中國煙草總公司四川省公司科技項目“煙草主要病蟲害綠色防控技術研究與應用”（SCYC201604）

徐同偉（1990-），男，碩士研究生，主要研究方向是植物病害防治。E-mail：xutongwei123@126.com。*通信作者，E-mail：13963973187@126.com

2016-11-22

2017-03-24