在云母晶面上應用“自下而上”和“自上而下”兩種途徑制造膠原蛋白納米線陣列

李力 張磊 楊德良 孫銘 曾凡喜 顧文華

(南京理工大學電子工程與光電技術學院，南京210094)

在云母晶面上應用“自下而上”和“自上而下”兩種途徑制造膠原蛋白納米線陣列

李力 張磊 楊德良 孫銘＊曾凡喜 顧文華＊

(南京理工大學電子工程與光電技術學院，南京210094)

以云母晶體的(001)晶面為基質，以天然Ⅰ型鼠尾膠原蛋白單體溶液為原料，分別考察了蛋白單體受基質規導進行“自下而上”的自組裝過程，以及原子力顯微鏡探針對吸附在基質表面的蛋白膜層進行“自上而下”加工過程：(1)兩種制備途徑均能加工出結構精確可控的膠原蛋白納米線陣列；(2)“自下而上”制備途徑利用了蛋白單體和基質晶體在界面上互相識別并規范的“反相生物礦化”原理；(3)“自上而下”的加工利用了原子力顯微鏡接觸模式下探針的“分子掃帚”機理。

膠原蛋白；自上而下；自下而上；納米線；介觀尺度

納米科技的興起顛覆了人們對傳統材料的認識觀，吸引了大量科學家在介觀尺度上的基礎研究，各種新型材料不斷地被開發出來[1-2]。在介觀尺度上，設計并合成新型的結構材料具有重要的理論與應用意義。以超材料為例，這是一類具有規則重復結構的人工復合材料，主要取決于其結構而不是其組成材料的本征特性，超材料能獲得自然界天然物質所不具備的超常理化性質，譬如負折射率等[3-6]。由于超材料的基元結構與電磁波波長要適度匹配，為將其應用延伸到短波段領域，構造介觀尺度上的基元結構至關重要[7]。在眾多的制備方法中，在無機晶體表面利用大分子的自組裝能力實現“自下而上”的結構合成和利用掃描探針的加工能力對樣品進行“自上而下”的操控是兩種重要的納米結構材料的制備技術。一方面，結合眾多不同微觀結構的無機晶體基質選擇以及有機化學帶來的尺寸與功能可調的分子合成技術，在超高真空背景下利用分子束沉積技術，或在液相中利用外延生長原理在基質表面控制有機分子膜層晶體“自下而上”(bottom-up)的有序生長為獲得功能可預測的微納光電材料與器件開啟了大門[8-14]。而在另一方面，自從人類首次實驗操控單個原子以來[15-16]，掃描探針顯微鏡利用“自上而下”(top-down)的微觀材料加工工藝，并通過融合其他領域的諸如譬如微接觸印刷和納米模板印刷技術，已經能夠快速地在基質表面形成具有規則排列的大分子陣列[17-19]，這為制造有規則微納基元結構的超材料提供了可能。對于生物大分子，該類技術還能保留原料的生物活性，這為制備高特異性的生物探針和生物芯片，合成新型微納生物材料提供了一種極為有效的方法。

最近，我們發展了2種新型納米線陣列的合成技術，所有制備操作均在室溫下進行，無需凈室或真空環境：(1)在電荷周期性分布的無機晶體表面利用具有自組裝能力的生物大分子通過液相外延生長“自下而上”地合成納米線陣列的“反相生物礦化”技術；(2)利用原子力顯微鏡(AFM)探針“自上而下”地將吸附在無機晶體表面的生物大分子膜層加工成納米纖維陣列的“分子掃帚”技術[20]。

本文以云母(mica，2M1muscovite)的(001)晶面為基質，以天然Ⅰ型鼠尾膠原蛋白單體為原料，同時考察了上述“自下而上”和“自上而下”的納米線陣列的制備過程。基質云母(mica，2M1muscovite)組成大致為{KAl2(AlSi3O10)(OH)2}，屬于單斜晶系(a= 0.529 06 nm，b=0.900 80 nm，c=2.004 70 nm，β= 95.757°)[21-23]。如圖1(A)所示，在每個單層里，中心的Al與O以八面體結構組合并被表面的Si/O層包夾，而Si/O以四面體結構連接形成六邊形的氧離子空洞來容納層間的K離子。

膠原蛋白是一類構成所有多細胞生物結締組織的主要組成成分的蛋白質的總稱。作為最重要的細胞外基質蛋白，膠原蛋白單體能自組裝成膠原纖維來構架并支撐幾乎所有無脊椎動物與脊椎動物的組織器官[24-26]。以最常見的Ⅰ型膠原蛋白為例，成纖維細胞最初合成的前膠原是由3股左手螺旋的α肽鏈在中部絞纏形成的右手超螺旋結構。α肽鏈具有重復的(Gly-X-Y)n結構，常見的有(Gly-Pro-Hyp)n。前膠原分泌到細胞外基質中后被內切酶切去C-末端與N-末端的球形結構而成為原膠原。這個繩狀的超螺旋分子正是組成膠原纖維的蛋白單體，長約300 nm，直徑約1.5 nm。每股螺旋由稍多于1000個氨基酸殘基組成，相對分子量約為95 000。圖1(B)顯示了以(Gly-Pro-Hyp)n為模型的原膠原超螺旋分子結構。盡管原膠原單股螺旋的周期為8.55 nm，但超螺旋結構沿軸向的殘基與電荷分布周期約為0.86 nm。在末端端肽的引導下，原膠原單體會互相錯開平行排列自組裝成細長的原纖維。在正常的生物礦化過程中，羥磷灰石，Ca10(PO4)6(OH)2會首先在纖維的特定位點結晶，并逐漸生長成帶狀小塊，最后形成高度有序的交錯結構。這種規范化的生物礦化之所以能順利進行是由于礦物質晶體與膠原蛋白纖維骨架在介觀尺度上均有規則的重復結構，通過諸多的靜電作用，蛋白纖維與礦物質晶體能夠互相識別從而有效地規范礦物質晶體生長。

圖1 (A)云母(2M1muscovite)的二層晶體結構圖;(B)以(Gly-Pro-Hyp)n為模型的膠原蛋白單體分子結構Fig.1(A)Structure of mica(2M1muscovite)two-layer unit cell;(B)Collagen monomer model(Gly-Pro-Hyp)n

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

膠原蛋白單體(Rat tail tendon collagen typeⅠ，5 mg·mL-1，溶解于6 mmol·L-1的乙酸)購自北京索萊寶科技有限公司。云母基片(mica，2M1muscovite)與載玻片購自北京中鏡科儀技術有限公司。膠帶購自3M公司。實驗室自制去離子水，室溫電阻率約18 MΩ·cm。

原子力顯微鏡(AFM：Bruker AXS，Dimension Icon)與探針(鍍金和鉻的硅材質，懸臂與針尖的力常數均為4.5 N·m-1，針尖高0.02 mm，錐角30°，曲率半徑50 nm)購自德國Bruker公司。聚焦離子束場發射掃描雙束電鏡(SEM：Auriga FIB，配3D背散射電子取向成像系統，空間分辨率50 nm)購自德國Zeiss公司。高分辨透射電鏡(TEM：FEI Tecnai G2 20 LaB6)購自美國FEI公司。透射/反射光譜儀，掃描范圍350～1 100 nm，掃描步長為5 nm，為實驗室自制。

1.2 納米線陣列的制備與表征

納米線陣列制備的基本步驟為：(1)以去離子水或磷酸鹽緩沖液為溶劑配制特定濃度的天然Ⅰ型鼠尾膠原蛋白單體溶液；(2)用透明膠帶撕開新鮮的云母(001)晶面后，立刻滴上膠原蛋白單體溶液覆蓋晶面約15 min；(3)除去云母晶面上的蛋白質溶液后，用無蛋白的溶劑小心清洗晶面1～2次以除去吸附不牢的蛋白質；(4)“自下而上”的自組裝：用無蛋白的磷酸鹽緩沖溶液覆蓋云母晶面培育12 h左右后即可進行表征；“自上而下”探針加工：無需培育，用去離子水覆蓋云母晶面即可進行加工與表征?！白韵露稀钡募{米線自組裝所用溶劑為pH=7.5的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖溶液，“自上而下”的納米線加工所用溶劑為去離子水。

在AFM接觸模式(contact mode)下，探針在溶液中“自上而下”地進行納米線加工。AFM輕敲模式(tapping mode)用于對樣品進行表征：探針振幅約100 nm，驅動頻率約8 kHz，接近探針懸臂在溶液中的共振頻率。電子衍射實驗：(1)在TEM模式下檢測到烘干樣品的膠原蛋白納米線結構之后，切換到NBD(nano-beam electron diffraction)模式對定點獲取電子衍射花樣，然后進行標定分析；(2)SEM/EBSD實驗前，對烘干樣品表面進行鍍金處理,厚度為5 nm，EBSD實驗設置加速電壓為20 kV，工作距離為13 mm。透射實驗：先將沒有鍍膜的干凈基片放置于樣品池做基線掃描，然后換成鍍了薄膜的基片進行光譜掃描，從而得到透射光譜。

2 結果與討論

2.1 AFM實驗結果

本實驗分別配制了不同濃度的Ⅰ型鼠尾膠原蛋白單體溶液進行納米線“自下而上”的的自組裝。圖2顯示的是膠原蛋白單體在云母(001)晶面上“自下而上”自組裝形成的納米線陣列的AFM圖。緩沖溶液均為pH=7.5的Na2HPO4/NaH2PO4溶液，其中(A)圖的膠原蛋白單體濃度為5 μg·mL-1，(B)圖的膠原蛋白單體濃度為10 μg·mL-1。很顯然，陣列中的納米線隨膠原蛋白單體濃度增大而變得更加致密，單條納米線更長，且納米線之間的交聯逐漸顯著。測量結果表明，由不同濃度的膠原蛋白單體溶液培育出的單條納米線的寬度與高度較為穩定，寬度約60 nm，高度約1.5 nm。

圖2 云母(001)晶面“自下而上”生長的膠原蛋白納米線陣列的AFM圖Fig.2AFM images of collagen nanowires bottom-up grown on mica(001)lattice plane

圖3 膠原蛋白覆蓋的云母晶面上同一區域的AFM圖Fig.3AFM images of the same collagen coated mica surface

圖3是利用AFM探針在接觸模式下“自上而下”制造蛋白納米纖維的過程。蛋白單體稀釋于去離子水中，濃度50 μg·mL-1。運用AFM輕敲模式對覆蓋蛋白膜層的云母表面不同位置進行表征，如圖3(A)所示，未發現圖2或文獻報道的自組裝而成的膠原蛋白纖維陣列[27-28]，這可能是單體濃度較大，蛋白質覆蓋較厚所致。另外，未使用文獻中的緩沖溶液也可能抑制成纖。然而在AFM接觸模式下對同一區域進行2次同樣的掃描，接著使用輕敲模式進行表征，得到如圖3(B)所示的膠原蛋白納米纖維陣列圖[20]。接觸模式的行掃描方向平行于探針懸臂方向(圖中用箭頭標出)，探針作用力設置為1×10-7N。圖中單根膠原蛋白納米纖維呈反復彎曲狀，但整個納米纖維陣列的取向較為一致，大致垂直于接觸模式的探針行掃描方向。數據分析結果顯示，單根蛋白納米纖維的長度從幾百納米到幾微米不等，平均高度約2 nm，寬度約150 nm，陣列中納米纖維間距并不均勻，從互相接觸到幾百納米不等。接觸模式下對同一區域進行2次同樣的掃描便可以得到排列規則的蛋白納米纖維陣列，2次以上掃描對單根納米纖維有顯著改變，但對納米纖維陣列的整體形貌影響不大。

2.2 “自下而上”的合成機理

生物礦化是動物世界普遍存在的現象。如前所述，礦物質在蛋白纖維的特定位點結晶，并逐漸生長最后形成高度有序的交錯結構。這種規范化的礦化之所以能順利進行是由于礦物質晶體與膠原蛋白纖維骨架在介觀尺度上均有規則的重復結構，通過諸多靜電作用，蛋白纖維與礦物晶體能夠互相識別從而有效地規范礦物晶體的生長。在另一方面，利用生物大分子與礦物質在界面的相互識別也能在礦物晶體表面來調控大分子的自組裝及成纖過程[27-29]，我們把這種生物大分子的外延生長現象稱為“反相生物礦化”。

隨化學氣相沉積(CVD)等真空外延技術發展起來的外延生長理論認為，兩個因素將決定外延晶體的結構:晶體界面上兩種物質分子間的結合力(化學鍵、靜電力、范德華力等)以及界面上的晶格匹配度[8-9]。在CVD操作的真空環境下,有機分子在無機晶體表面的外延生長僅受控于較弱的靜電力與范德華力,因此有機分子可在加熱的基質表面漂移。盡管兩種物質的晶格并不匹配,但基質表面的電荷分布仍能對有機分子的取向起到規范作用。這樣，取向被規范的有機分子單體在基質晶面上漂移時便碰撞結合形成晶種,并生長成更大的二維晶體,甚至形成有特定取向的納米線陣列[13-14]。本實驗中培養膠原蛋白納米線的液相環境稍顯復雜,在界面上除了云母晶面與吸附在晶面上的膠原蛋白單體的結合力外，另一個重要的作用力就是水分子與云母晶面上單層蛋白單體之間的熵力(entropy force),可在常溫下推動蛋白單體在云母晶面上漂移,從而有助于膠原蛋白自組裝生成納米線纖維。由于納米線的形成是單體分子在二維晶面上側向結合所致,因此在一定的單體濃度范圍內,納米線有恒定高度和寬度。

圖4 云母晶體表面的氧負離子在(001)晶面上的投影Fig.4Oxygen atoms of mica unit cell projected onto the(001)lattice

本實驗所用的單斜礦物晶體云母(mica，2M1muscovite)的晶胞是互成120°的雙層結構[21-23]，因此云母片可以層層撕開而露出與前一層原子排列成120°的嶄新晶面。如圖4所示，在每個單層里，中心的Al與O以八面體結構組合并被表面的Si/O層包夾。(001)晶面的Si/O以四面體結構連接形成六邊形的氧離子空洞來容納層間的K離子。由于Si/O四面體結構的變形導致一部分氧離子凹陷下去0.022 nm，使得氧離子空洞成不規則六邊形，并在整個晶面上形成圖4所示沿[110]方向，與[001]晶軸成60°的帶負電狹長凹槽，這也是(001)晶面上電荷分布的二次對稱軸。該對稱軸使得唯有沿[110]方向或垂直于[110]方向的電荷分布是唯一的。到目前為止，盡管有報道稱膠原蛋白在無機晶面的自組裝受晶體表面電荷分布所規范[27-28]，但尚未有詳實精準的晶體結構表征實驗來確證該類納米線陣列是蛋白單體在“反相生物礦化”原理下的準外延生長現象。根據云母(001)晶面上電荷分布的對稱性以及我們觀測到膠原蛋白納米線陣列取向的單一性，我們也許可以推斷蛋白單體受云母晶面上電荷分布的規導，其取向要么平行于該狹長氧負離子凹槽，即[110]方向，要么垂直于該方向，并在熵力的作用下進一步自組裝成取向獨特的納米線陣列。

我們對覆蓋納米纖維膜層的云母基片進行了TEM的選區衍射(SAED)實驗和SEM的背散射衍射(EBSD)實驗。如圖5所示，通過對TEM的選區電鏡圖像和SAED衍射光斑的標定與坐標分析，納米線的取向大致與云母[001]晶軸成60°，這與文獻報道Laue衍射實驗結果一致[27]，但仍不能確定是沿云母[110]還是[110]方向。

幸運的是，EBSD實驗得到了某特定樣品選區SEM圖像以及該區云母晶體衍射花紋圖。如圖6所示，基于對該區多點的標定和坐標分析，納米線取向平行于云母[001]晶軸。這可能是制樣過程中對云母晶面造成破壞，使下層扭轉120的晶面露出所致。這直接排除了納米線沿云母[110]方向或垂直[110]方向?；陔娮友苌鋵嶒灲Y果，以往實驗報道[27]膠原蛋白沿云母[110]方向生長可能有誤。

圖5 膠原蛋白納米纖維陣列覆蓋的云母晶面的TEM/SAED實驗結果:(A)未聚焦的選區TEM照片,納米纖維可見; (B)圖A中無纖維占據的圓點處的衍射圖Fig.5TEM/SAED experimental results of mica surface covered with collagen nanowires:(A)Typical defocused TEM image with collagen nanowires visible;(B)Diffraction pattern taken from the red circle of A

圖6 膠原蛋白納米纖維陣列覆蓋的云母晶面的EBSD實驗結果:(A)選區SEM照片,噴金后的納米纖維可見; (B)無纖維占據處的云母晶體衍射圖Fig.6EBSD experimental results of mica surface covered with collagen nanowires:(A)SEM image of gold coated mica with collagen nanowires visible;(B)diffraction pattern of mica taken from an empty zone

2.3 “自上而下”的加工機理

圖7 AFM接觸模式下的“分子掃帚”機理Fig.7‘Molecular broom’mechanism in AFM contact mode

對于圖3中利用AFM探針“自上而下”地制造膠原蛋白纖維陣列，“分子掃帚”(molecular broom)機理也許能給出最合理的解釋[30]。如圖7(A)所示，樣品作用于探針上的力可分解成水平與垂直方向，其中垂直方向的力會使懸臂發生彎曲。在接觸模式下，垂直方向的力或懸壁的彎曲度應保持恒定，這由壓電傳感器通過調節懸臂高度來控制。當樣品分子與基質結合力較弱時，探針將樣品分子推動，像掃帚一樣在圖B中掃動分子并堆積起來。此時探針受力和懸臂彎曲度增大，當垂直方向的力大過閾值時，壓電傳感器便將懸臂上提以緩解壓力。于是，探針便如圖C所示滑過堆積的樣品分子表面。隨著垂直方向的力進一步減小，在圖D中壓電傳動系統將探針再次放低來進行新一輪的“分子掃帚”運動。這樣，每一行掃描結束后，探針會將樣品分子掃成幾堆。當接下來的一行掃描時，又會形成新的樣品分子堆積。如果行距合適使得相鄰兩行的樣品分子堆能相互接觸，它們便隨機結合形成了呈之字形彎曲的單根纖維，因此其取向大致垂直探針的行掃描方向。

圖8 AFM探針在云母晶面“自上而下”地制造膠原蛋白納米線陣列Fig.8Collagen nanowires‘top-down’created by AFM tip on mica lattice plane

為進一步印證以上的“分子掃帚”機理，我們進行了以下實驗。圖8所示的是在10 000 nm×10 000 nm區域利用AFM探針在接觸模式下“自上而下”地制造的蛋白納米纖維。圖中箭頭平行于探針懸臂。首先，在A區域(5 000 nm×5 000 nm)利用AFM接觸模式連續掃描2次，行掃描方向垂直于探針懸臂方向，探針作用力設置為2×10-7N。緊接著在B區域(2 500 nm×2 500 nm)使用同種模式、相同方向以及相同探針作用力進行2次連續掃描。接下來，在C區域(5 000 nm×5 000 nm)利用接觸模式連續掃描2次，行掃描方向平行于探針懸臂方向，探針作用力增加到5×10-7N。接著，在D區域(2 500 nm× 2 500 nm)使用同種模式和相同方向進行2次連續掃描，但是探針作用力增加到1×10-6N。最后，我們在AFM輕敲模式下對整個區域進行表征，得到了圖8中分塊的膠原蛋白納米纖維陣列圖。很顯然，A區域和C區域的納米纖維陣列的取向互相大致垂直，但均垂直于接觸模式下探針的行掃描方向。對比A區域(纖維高度約5 nm，寬度約270 nm)，B區域由于掃描行間距變小產生更大重疊區域，蛋白纖維變得稀疏和粗壯(纖維高度約5 nm，寬度約350 nm)。在C區域，由于探針作用力進一步增加，大量蛋白分子被探針帶出該區域，纖維變得稀疏單薄。在D區域，由于探針作用力過大，蛋白分子基本上被探針“掃”走了。

2.4 透射實驗結果

我們利用自制的透射/反射光譜儀在350～1 100 nm的范圍內測量了2種不同機理制造的納米線陣列的透射譜。如圖9所示，“自下而上”自組裝形成的納米線陣列的透射率略好于“自上而下”加工而成的納米線陣列。這可能與云母晶面上吸附的蛋白質的量有關。但是，對于“自下而上”自組裝形成的納米線陣列，5或10 μg·mL-1的蛋白單體濃度對透射率沒有統計上的影響。

圖9 云母晶面上“自下而上”和“自上而下”地制備的膠原蛋白納米線陣列的透射率Fig.9Transmittance of collagen nanowires created by‘bottom-up’and‘top-down’approaches on mica lattice plane

3 結論

以天然Ⅰ型鼠尾膠原蛋白單體為原料，云母(001)晶面為基質，分別實現了“自下而上”和“自上而下”的蛋白納米線陣列的制備，并對制備機理進行了初步探討。在材料合成領域，有報道稱通過“自下而上”和“自上而下”合成途徑能殊途同歸地獲得性能一致的納米顆粒材料[31]。但就我們所知，目前尚無同種生物大分子在同一基質表面利用不同機理生成納米線陣列的文獻報道。本研究屬于仿生合成領域內較前沿的“過程仿生合成”范疇[32-33]，其機理研究對制備生物納米材料具有一定的指導意義。當前，利用大分子在基質表面有序排列可以構造掩模合成新型微納光電材料與器件，生產細胞培養器皿、制備高效生物探針[32-37]。本實驗則為以上諸多應用提供了2種實驗條件要求相對較低，但所合成的目標材料結構可控的潛在高效制備技術。我們還需要后續的各種表征實驗來探索以上技術的潛在應用。

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Creating Collagen Nanowire Arrays by‘Bottom-Up’and‘Top-Down’Approaches on Mica Lattice Planes

LI LiZHANG LeiYANG De-LiangSUN Ming＊ZENG Fan-XiGU Wen-Hua＊
(School of Electronic Engineering and Optoelectronic Technology,Nanjing University of Science and Technology,Nanjing 210094,China)

By using the mica(001)lattice plane as the substrate and rat tail typeⅠcollagen monomers as adsorbates,both‘bottom-up’self-assembly of protein monomers guided by the substrate and‘top-down’manipulation of protein membrane by AFM tip were investigated:(1)both preparation approaches can fabricate collagen nanowire arrays with precisely controllable structures;(2)the‘bottom-up’approach was due to the‘reverse-phase biomineralization’mechanism arising from the cooperative recognition and regulation between the protein and substrate at the interface;(3)the‘top-down’manipulation was based on the‘molecular broom’mechanism of the AFM tip in the Contact Mode.

collagen;bottom-up;top-down;nanowire;mesoscale

O629.73

A

1001-4861(2017)05-0745-08

10.11862/CJIC.2017.100

2016-11-25。收修改稿日期：2017-03-04。

國家自然科學基金(No.51303082)，中央高?；究蒲袠I務費專項資金(No.30915011316)和江蘇省“高層次創新創業人才引進計劃”資助項目。

＊通信聯系人。E-mail：msun@njust.edu.cn，guwenhua@njust.edu.cn