實驗性自身免疫性神經炎大鼠模型的制備與評價

張明　原曉晶　敖強

[摘要] 目的 探索實驗性自身免疫性神經炎（EAN）動物模型的建立和相關指標的評價。 方法 將20只體重140～160 g的 Lewis雌性大鼠隨機分為EAN組（n = 10）和對照組（n = 10），并對各組從1～10進行編號。EAN組采用P0180-199多肽免疫，對照組注射生理鹽水；免疫后觀察42 d，記錄行為學變化并評分；免疫后第18天檢測兩組大鼠神經肌肉動作電位、坐骨神經電鏡組織學及免疫組織化學、腓腸肌HE染色等指標。 結果 EAN組高峰期坐骨神經復合動作電位傳導速度低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），振幅明顯低于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。電鏡結果顯示EAN組大鼠坐骨神經髓鞘結構腫脹、蜂窩改變、脫失，軸突變細或消失。HE染色結果顯示EAN組大鼠腓腸肌纖維變細、胞漿淡染等炎癥退行性改變。免疫組化結果顯示坐骨神經髓鞘結構以水腫、脫失為主者炎癥因子Iba-1（巨噬細胞）、CD3（T 細胞）增多；坐骨神經髓鞘結構以脫失為主者神經軸蛋白NF200減少；坐骨神經髓鞘結構以蜂窩狀改變、脫失為主者神經髓鞘蛋白S100減少。 結論 采用P0180-199誘導的自身免疫性神經炎模型發病率高，容易復制，病理改變接近臨床特發性神經炎。本研究EAN發病高峰期的各項評價指標為該模型進一步的病生理過程探討提供了依據。

[關鍵詞] 實驗性自身免疫性神經炎；模型；脫髓鞘

[中圖分類號] R745.430.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（c）-0026-05

[Abstract] Objective To explore the establishment of experimental autoimmune neuritis （EAN） rat model and the evaluation of related indexes. Methods Twenty female Lewis rats weighing 140-160 g were randomly divided into EAN group （n = 10） and control group （n = 10）， and the number of each group was 1-10. The EAN group was immunized with P0180-199 peptide. The control group was injected with saline. After 42 days of immunization， the behavioral changes were recorded and scored. At the eighteenth days after immunization， the nerve-muscle action potential， sciatic nerve electronic microscope and immunohistochemistry and HE staining of gastrocnemius muscle and other indicators of the rats in the two groups were detected. Results The sciatic nerve conduction velocity in the peak of the compound action potential in the EAN group was lower than that of control group， with statistically significant difference （P < 0.05）， and the amplitude was obviously lower than that of control group， with highly statistically significant difference （P < 0.01）. The results of electron-microscope showed swell， honeycomb changes and miss out of myelin sheath， with an attenuation or disappearance of axon in the EAN group. The results of HE staining showed thinning of gastrocnemius-myofibers and stained cytoplasm and other degenerative changes in the EAN group. The results of immunohistochemistry showed that inflammatory factors Iba-1 （macrophage） and CD3 （T cells） were increased in those with swell and miss out of myelin sheath. The axonal protein NF 200 was decreased in those with miss out of myelin sheath. The myelin protein S100 was decreased in those with honeycomb changes and miss out of myelin sheath. Conclusion The autoimmune neuritis model induced by the P0180-199 has high incidence and easy copy， and the pathological changes are close to clinical idiopathic neuritis. In this study， the evaluation indexes of EAN during peak hours provide a basis for the further study of the physiological process of this disease.

[Key words] Experimental autoimmune neuritis； Model； Demyelination

實驗性自身免疫性神經炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）是國際上公認的吉蘭-巴雷綜合征（Guillian-Barre syndrome，GBS）的經典動物模型，該動物模型的建立對GBS自身免疫性機制的假說起到了很大的支持作用[1-4]。Waksman等在1955年首次使用周圍神經勻漿在兔子身上建立了人類GBS模型[5]。其后，研究者們通過純化的外周神經組織勻漿、髓鞘蛋白或合成多肽，來誘導各種易感動物模型，也有研究者將具有抗原特異性T細胞系靜脈注入動物體內，來誘導具有抗原特性的EAN模型[6-7]，其中最為廣泛應用的是通過外周神經勻漿、髓鞘蛋白或合成多肽誘導的Lewis大鼠模型，例如采用P0180-199配以不完全弗氏佐劑免疫[8-9]。EAN典型病理表現是T細胞和巨噬細胞浸潤，外周神經組織水腫及脫髓鞘[10-12]，坐骨神經及腰髓神經根病理改變最明顯，而頸叢神經及頸髓神經根則不明顯[7]。1975年Allt[13]通過電鏡對兔EAN模型外周神經進行觀察，發現了髓鞘的兩種變化：髓鞘蜂窩改變和髓鞘脫失。對于坐骨神經組織水腫的病理改變，Izumo等[14]曾通過神經內膜的白蛋白和纖維蛋白原免疫組化的檢測予以證實，但沒有更進一步細致的研究。本研究觀察Lewis雌性大鼠EAN模型行為學、外周神經電生理、組織病理學等各方面的變化，并重點研究外周神經超微結構變化及分類，探討其與炎癥因子、髓鞘蛋白、軸突蛋白間的聯系，進而探討疾病形成機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由于自身免疫性神經炎是一種短時程自限性疾病，雌性Lewis大鼠性情比較溫順，對于給藥注射免疫應急反應良好，所以采用健康純系雌性Lewis大鼠20只，6～8周齡，體重140～160 g，并委托清華大學動物平臺購自北京維通利華（Vital River）公司[合格證號：SCXK（京）2014-0007]，晝夜12 h交替光照，自由攝食飲水，在室溫（20±2）℃條件下飼養，隔日更換墊料。實驗過程由清華大學動物倫理委員會審核通過。

1.2 儀器與試藥

P0180-199（SSKRGRQTPVLYAMLDHSRS）多肽購自安徽瀚海博興生物技術有限公司；不完全氟氏佐劑（Incomplete Freund's Adjuvant，IFA）購自美國Sigma公司；結核分枝桿菌（H37Ra）購自美國DIfco公司。臺式離心機（5424）購自Eppendorf公司；電生理儀（RM-6240BD/CD生物信號采集處理系統2.02版）購自成都儀器廠；透射電子顯微鏡（JEM-1200EX）購自NIKON公司（日本）；激光共聚焦顯微鏡（FV10i-oil）購自Olympus公司（日本）。

1.3 造模與分組

健康純系Lewis雌性大鼠20只，按隨機數字表隨機分成兩組，每組10只，EAN組（P0180-199），對照組（生理鹽水）。將200 μg P0180-199、1 mg H37Ra、100 μL生理鹽水、100 μL IFA混合液充分乳化，作為一只大鼠的注射用量，注射入雙后肢足底皮下（每只足底100 μL）。對照組注射生理鹽水100 μL。老鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后在兩側腳掌部位用1 mL注射器分別打入100 μL以上混合好的造模試劑和對照組等量的生理鹽水。造模成功的標準主要看大鼠形態學上的變化，足底發紅腫脹，嚴重時出現潰瘍，尾巴下垂甚至拖地，后肢對于外界刺進反應遲緩等因素結合考慮。

1.4 臨床評分

免疫當天即第0天開始每天對兩組大鼠進行稱重、行為學評分記錄，一直到免疫第42天時結束。評分標準，正常：0分；尾巴拖地或尾尖上翹：1分；翻正反射受損：2分；中度癱瘓：3分；重度癱瘓：4分；四肢癱瘓或死亡：5分[8]。癥狀介于中間時評分值±0.5分。

1.5 神經電生理

免疫第18天時每組大鼠各取5只，稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉按照3 mg/100 g，進行麻醉，放置刺激電極、無關電極及記錄電極。采用電生理儀檢測并記錄神經-肌肉動作電位（compound muscle action potentials，CMAPs）。將檢測數據代入公式：CCV（m/s）=刺激電極與記錄電極間的距離/傳導時間，計算測定部位的MNCV。

1.6 組織學觀察

免疫第18天時取大鼠腓腸肌標本，進行HE染色：冰凍切片固定15～30 s，稍水洗3～5 s；蘇木精液染色（60℃）8 min；流水洗去蘇木精液5 min；1%鹽酸乙醇5～10 s，流水沖洗30 s；促藍液返藍5～10 s，流水沖洗15～30 s；伊紅染色50 s，蒸餾水稍洗4～6 s；脫水，透明，中性樹膠封固，光鏡觀察。

1.7 透射電鏡觀察神經超微結構

免疫第18天時電生理檢測后處死大鼠，避開刺激電極接觸部位，雙側坐骨神經各取1 cm長神經，并固定于2.5%戊二醛中。PBS沖洗后經系列脫水，無水乙醇，15 min，95%丙酮15 min；無水丙酮10 min，5 min換液1次。包埋：將組織放入包埋劑氧化丙烯（1∶1）溶液中1 h，純包埋劑中3 h。超薄切片后用醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色。透射電子顯微鏡觀察、攝片。

1.8 免疫組織化學

免疫第18天時從大鼠坐骨神經根部取約1 cm長神經做免疫組化。免疫組織化學染色標記大鼠坐骨神經CD3（T細胞）、Iba-1（巨噬細胞）、S100（雪旺細胞）、NF200（軸突細胞）。免疫熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡分析照相。

1.9 統計學方法

運用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型鼠發病及評分情況

EAN組大鼠從免疫第1天開始出現不同程度的臨床癥狀，包括精神不振、皮毛不潔、雙后足紅腫、體重下降等，免疫第7天時兩組所有大鼠均出現尾巴拖地行為，即行為學評分1分，提示造模成功。第16～17天癱瘓達到高峰，第18天后逐漸緩解，高峰持續約10 d，隨后臨床評分有所下降。EAN組和對照組臨床評分結果見圖1。

2.2 神經電生理結果

EAN組坐骨神經傳導速度為（19.69±4.47）m/s，低于對照組[（30.98±2.71）m/s]，差異有統計學意義（P < 0.05）；EAN組坐骨神經動作電位振幅為（2.12±0.83）mV，明顯低于對照組[（12.18±1.71）mV]，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 組織學觀察結果

對照組大鼠腓腸肌表現為胞膜完整，胞質染色均勻，胞核位于細胞邊緣，肌纖維間的空隙較小。EAN組大鼠腓腸肌可見胞膜不完整，胞質染色變淺且不均勻，胞核位于細胞中央甚至消失，肌纖維變細、排列雜亂，空隙增大。見圖3。

2.4 電鏡結果

對照組：神經纖維髓鞘和軸索結構正常，圓心軸索周圍有層狀髓鞘板層結構包饒。EAN組：髓鞘板層腫脹；蜂窩狀改變；髓鞘剝脫。見圖4～5。

2.5 免疫熒光化學結果

對照組：髓鞘緊密包饒在軸突外層，軸突結構明顯，有散在的炎癥因子。EAN組：①髓鞘腫脹。髓鞘結構變粗，有較多炎癥因子。②髓鞘剝脫。髓鞘結構明顯減少；軸突變細、減少，有較多炎性因子。③髓鞘蜂窩狀改變。髓鞘結構呈蜂窩狀，炎癥因子明顯少。見圖6～8（封三、封四）。

3 討論

本研究采用大鼠進行模型試驗，相對于家兔實驗容易操作，給藥劑量容易把控，在模型建立成功的基礎上家兔對于疾病的耐受較差，容易導致死亡。評價方法方面大鼠在對于變態反應性方面更加明顯，拖尾程度也是重要的參考標準之一。本研究使用P0180-199誘導Lewis雌性大鼠成功的造模，對以往文獻中使用P0180-199造模的過程加以驗證[8，15]。采用單盲法觀察，六級評分法作為評分標準[16-17]。EAN組大鼠免疫第1天開始出現不同程度的臨床癥狀，包括精神不振、皮毛不潔、雙后足紅腫、體重下降等，類似于GBS發病前的病毒感染癥狀[18]，與免疫原引起全身免疫反應有關；免疫第7天時兩組大鼠均出現尾巴拖地行為，即行為學評分1分，提示造模成功。第16～17天癱瘓達到高峰，第18天后逐漸緩解，高峰持續約10 d，隨后臨床評分有所下降。

電生理檢測結果顯示，與對照組相比，EAN組坐骨神經傳導速度減慢，振幅也明顯降低，差異有統計學意義。傳導速度反映的是傳導最快神經纖維的速度[19]，與神經軸數量無關，間接反映了神經脫髓鞘的病變程度。振幅主要與軸突數量有關，數量越多，振幅就越高[20]。

HE染色結果顯示，EAN組腓腸肌可見胞膜不完整，胞質染色變淺且不均勻，胞核位于細胞中央甚至消失，肌纖維變細，排列雜亂，空隙增大，而臨床癥狀表現為后肢腫脹，潰爛，不能自力行走，或拖著后肢緩慢行走，運動量顯著降低，說明在運動減少后肌肉出現明顯的退行性改變，因為運動功能障礙運動量減少可能引起肌肉的廢用性萎縮[21]。

透射電鏡神經超微結構結果顯示，在EAN組大鼠癥狀達到高峰期時出現了四種病理結果： 髓鞘腫脹；髓鞘剝脫；髓鞘蜂窩狀改變；軸突變細或消失，對Allt[13]電鏡病理結果進行了補充和完善。雖然有關于通過免疫組織化學觀察到EAN模型髓鞘腫脹的報道[14]，但目前尚未見到使用電鏡觀察到這種病理現象的相關報道。免疫組化結果顯示，炎癥因子Iba-1和 CD3在髓鞘腫脹中表達最多，髓鞘剝脫中次之，而在蜂窩狀改變中的表達量最少，接近正常，說明髓鞘腫脹、剝脫與免疫反應中T細胞和巨噬細胞的攻擊有密切關系，而髓鞘蜂窩狀的改變與之關系不大。這對EAN神經病理生理的進一步研究有促進作用。

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（收稿日期：2017-02-04 本文編輯：張瑜杰）