大鼠肺缺血再灌注損傷模型中TLR4信號通路介導HIF—1α的變化及其意義

才開·莎熱麗　徐思成　李超

[摘要] 目的 探討大鼠肺缺血再灌注損傷（IRI）模型中Toll樣受體4（TLR4）信號通路介導缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的變化及其意義。 方法 選取48只健康雄性SD大鼠，采用隨機數字表法分為假手術組、IRI模型組、TLR4激活組（脂多糖干預）、TLR4抑制組（TAK-242干預），每組各12只大鼠。造模前3周時，IRI模型組和假手術組靜脈注射生理鹽水，TLR4激活組靜脈注射脂多糖，TLR4抑制組靜脈注射TAK-242，每周1次，連續3周。IRI模型組、TLR4激活組和TLR4抑制組均于末次注射30 min后建立肺缺血再灌注損傷模型。假手術組除不阻斷肺門外，其他操作方法同前。再灌注損傷后3 h采用逆轉錄聚合酶聯反應（RT-PCR）檢測各組大鼠肺組織中Toll樣受體4（TLR4）、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）mRNA表達，采用免疫印跡法（Western-blot）檢測各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6蛋白表達水平。 結果 肺濕重/干重值IRI模型組高于假手術組（P < 0.05），TLR4激活組高于IRI模型組（P < 0.05），TLR4抑制組低于IRI模型組（P < 0.05）；肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表達水平IRI模型組高于假手術組（P < 0.05），TLR4激活組高于IRI模型組（P < 0.05），TLR4抑制組低于IRI模型組（P < 0.05）。 結論 大鼠肺IRI后，肺組織中TLR4信號通路介導HIF-1α的水平顯著升高，會增加對肺組織的炎癥損傷程度。

[關鍵詞] 肺缺血再灌注損傷；Toll樣受體4；缺氧誘導因子-1α

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（c）-0018-05

[Abstract] Objective To investigate the changes and significance of hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） mediated by Toll like receptor 4 （TLR4） signal pathway in the model of lung ischemia reperfusion injury （IRI） rats. Methods A total of 48 healthy male SD rats were selected and randomly divided into sham operation group， IRI model group， TLR4 activation group （LPS intervention） and TLR4 inhibition group （TAK-242 intervention） with 12 rats in each group. 3 weeks before model， IRI model group and sham operation group were injected with saline， TLR4 activation group was injected with lipopolysaccharide， TLR4 inhibition group was injected with TAK-242， once a week for three weeks. IRI model group， TLR4 activation group and TLR4 inhibition group were established a model of lung ischemia-reperfusion injury after last injection 30 minutes， sham operation group was treated same as the other groups except for not block the lung door. 3 hours after reperfusion injury， TLR4， HIF-1α， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） mRNA expression of lung tissue were tested by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR）. TLR4， HIF-1α， TNF-α and IL-6 protein expression of lung tissue were tested by Western-blot. Results The lung wet weight/dry weight ratio of the IRI model group was higher than that of the sham operation group （P < 0.05）， the TLR4 activation group was higher than that of the model group （P < 0.05）， and the TLR4 inhibition group was lower than that of the model group （P < 0.05）. The mRNA and protein expression levels of TLR4， HIF-1α， TNF-α， IL-6 in the lung tissues of IRI model group were higher than those of the sham operation group （P < 0.05）， the TLR4 activation were higher than those of the model group （P < 0.05）， and the TLR4 inhibition group were lower than those of the model group （P < 0.05）. Conclusion The TLR4 signal pathway in the lung tissue mediates the HIF-1α expression increased significantly after lung ischemia-reperfusion injury in rats， and increases the degree of inflammatory damage to the lung tissue.

[Key words] Ischemia reperfusion injury of lung； Toll like receptor 4； Hypoxia inducible factor-1α

肺缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是臨床心肺術后較為常見的并發癥之一，其可誘發一系列復雜的級聯反應并導致肺損傷，嚴重影響患者的預后效果[1-3]。研究表明，IRI的發生和發展是一個復雜的病理過程，涉及炎性反應、氧化應激反應、自由基產生、促炎介質釋放等過程[4]。而局部炎性反應又可誘發全身性炎性反應甚至是器官衰竭的發生，最終可導致死亡[5-8]。Toll樣受體4（TLR4）信號通路被認為是炎性反應的重要信號因子，而缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）是缺氧的信號因子之一，且二者之間具有相互調控機制，可進一步導致促炎性反應的發生，進而參與IRI的發生和發展[9]。為此，本研究探討分析了大鼠肺IRI模型中TLR4信號通路介導HIF-1α的變化及意義，為臨床上尋求新的治療靶點提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取48只健康雄性SD大鼠，均為SPF級，4～6周齡，體重250～300 g，平均（278.9±10.3）g，購買于新疆醫科大學動物實驗中心（動物合格證號：XJYKDX-20160317002），喂養于光照12 h、相對濕度45%～60%、溫度23～25℃的實驗室中。

1.2 藥品、儀器

TAK-242、戊巴比妥鈉、脂多糖、辣根過氧化物酶（HRP）均購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國Epitomics公司；單克隆兔抗TLR4、單克隆兔抗HIF-1α、單克隆兔抗TNF-α、單克隆兔抗IL-6均購自美國Epitomics公司；TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6引物均購自上海生工生物工程有限公司。

動物呼吸機購自北京眾實迪創科技公司，電泳槽購自美國Bio-Rad公司，RT-PCR儀購自美國應用生物系統公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 分組與造模

將48只大鼠隨機分成四組，即假手術組、IRI模型組、TLR4激活組和TLR4抑制組，每組各12只。其中，IRI模型組和假手術組于造模前3周靜脈注射2 mL生理鹽水，TLR4激活組于造模前3周靜脈注射脂多糖（1.50 mg溶于2 mL生理鹽水），TLR4抑制組于造模前3周靜脈注射TLR4特異性抑制劑TAK-242（10 mg/kg溶于2 mL DMSO）進行干預，每周1次，連續3周。IRI模型組、TLR4激活組和TLR4抑制組均于末次注射30 min后建立肺缺血再灌注損傷模型，方法如下：大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，同時皮下注射肝素1000 U/kg，經口氣管插管后接動物呼吸機，通氣頻率為70次/min，潮氣量為10 mL/kg。在大鼠左側第五肋間做長約3 cm的切口，切開胸廓后暴露左肺門，待大鼠吸氣時完全阻斷左肺門，45 min后恢復血流灌注，3 h時完整切取左肺。假手術組除不阻斷肺門外，其他操作方法同前。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 肺組織濕重/干重值檢測 取部分左肺組織稱量濕重，隨后將其置于65℃烤箱中72 h，稱量干重后計算左肺濕重與干重比值。

1.4.2 RT-PCR檢測 取部分肺組織采用RNA提取試劑盒提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄為DNA，在聚合酶的作用下進行擴增。引物如下：TLR4上游：GTTCATCTGCTTTCTGCTG，下游：TGATTCTGCCTGA-TGTTGC；HIF-1α上游：GTTTACTAAAGGACAAGTCACC，下游：TTCTGTTTGTTGAAGCAG；IL-6上游：ACTGCCTTCCCTACTTCACA，下游：TCGCTGTTCATACAATCAGA；TNF-α上游：AATCAGCCTCCCTCAT-CAGTT；下游：CCACTTGGTGGTTTGCTACGA；β-actin上游：GCCATGTACGTAGCCATCCA，下游：GAACCGCT-CATTGCCGATAG。擴增條件如下：95℃ 10 min，然后以95℃ 15 s、60℃ 60 s為1個循環，共進行40個循環。具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。電泳后得到目的條帶的光密度值與β-actin光密度值進行比較，最終得出TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平。

1.4.3 Western-blot檢測 取大鼠肺組織制備蛋白樣，并取約75 μg以10%十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，分離后轉移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；加入一抗（TLR4、TNF-α、IL-6和HIF-1α）后4℃孵育過夜，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP標記的二抗進行反應，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次用化學發光法進行顯色，并采用軟件進行灰度值分析，計算各目標蛋白與β-actin的灰度比值。

1.4.4 HE染色 取各組大鼠部分新鮮肺組織，以4%中性甲醛溶液固定后做連續切片，常規HE染色后進行病理檢測，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法

采用SAS 10.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理學觀察

圖1為各組大鼠肺組織HE染色后100倍光鏡下觀察，假手術組肺組織未見明顯異常，肺泡組織結構清楚，僅見極少量紅細胞及炎癥細胞浸潤于肺泡腔；B為IRI模型組可見肺泡結構紊亂，肺泡間隙增寬，肺毛細血管充血明顯，肺泡腔內大量的紅細胞，炎性細胞浸潤；TRL4激活組可見大鼠肺組織病變程度較IRI模型組更加嚴重；TRL4抑制組可見大鼠肺組織中的病變程度較IRI模型組輕微。

2.2 各組大鼠肺濕重/干重值比較

IRI模型組肺濕重/干重值高于假手術組，TLR4激活組肺濕重/干重值高于IRI模型組，TLR4抑制組肺濕重/干重值低于IRI模型組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平比較

IRI模型組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平均高于假手術組，TLR4激活組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平高于IRI模型組，TLR4抑制組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平低于IRI模型組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平比較

IRI模型組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平高于假手術組，TLR4激活組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平高于IRI模型組，TLR4抑制組肺組織中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達水平低于IRI模型組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表3、圖2。

3 討論

肺IRI是一種較為復雜的病理、生理過程，多在肺移植、體外循環、肺袖式切除、肺動脈成形、肺動脈血栓內膜剝脫、心肺復蘇及創傷等情況下發生，患者表現多為肺水腫、肺血管阻力增加、微循環通透性增加、肺動脈高壓等，嚴重時甚至導致死亡[10-12]。研究表明，肺缺血再灌注損傷的發生和發展與炎癥介質釋放、氧化應激反應、細胞內轉超載、細胞死亡誘導、中性粒細胞活化以及保護性介質的減少等因素有關[13-14]，其中，炎性反應和缺氧在這一過程中發揮了重要的作用。有研究表明，炎癥和缺氧可以協同作用，炎癥環境會導致氧含量持續下降，而細胞耗氧量的增加又會導致炎性反應和組織損傷的加劇，進而促進缺血再灌注損傷的發展[15-16]，但是具體機制目前尚不完全清楚，可能與TLR4信號通路介導HIF-1α的變化有關。因此，本研究將大鼠分別靜脈注射脂多糖、TAK-242和生理鹽水干預后再建立肺缺血再灌注損傷，并對各組再灌注損傷后3 h的相關實驗室指標進行了分析比較。

本研究發現，建立灌注模型后，IRI模型組大鼠病理檢測發現肺泡結構紊亂，炎性反應較為明顯，TRL4激活組大鼠的肺組織病變程度較IRI模型組更加嚴重，而TRL4抑制組大鼠肺組織中的病變程度較IRI模型組輕微；IRI模型組大鼠肺濕重/干重值高于假手術組，TLR4激活組肺濕重/干重值高于IRI模型組，而TLR4抑制組肺濕重/干重值低于IRI模型組，上述結果提示肺缺血再灌注模型建立成功。TRL4激活組添加脂多糖后大鼠肺部可見明顯炎性反應，且肺濕重/干重值明顯偏高，而TLR4抑制組添加TRL4抑制劑后炎性反應明顯降低，進一步說明TRL4在肺缺血再灌注損傷的發生和發展過程中發揮了重要作用，但其具體機制仍需做進一步深入研究。

本研究利用RT-PCR技術和Western-blot技術分別對各組大鼠肺組織中TLR4、HIF-1α mRNA和蛋白水平進行檢測發現，IRI模型組大鼠肺組織mRNA和蛋白水平均明顯高于假手術組，而TLR4激活組較IRI模型組更高，TLR4抑制組mRNA和蛋白水平均明顯低于IRI模型組，提示脂多糖能明顯激活TLR4通道，促進TLR4的分泌和相關蛋白的表達，而利用TLR4特異性抑制劑將TLR4通道抑制后可明顯降低TLR4、HIF-1α mRNA及蛋白表達水平。

HIF-1α是一種重要的缺氧相關調節因子，其可與下游的缺氧反應元件結合后調控下游基因的激活，而HIF-1α與TLR4之間也存在著密切聯系[17]。本研究發現，特異性TLR4配脂多糖干預后可明顯促進HIF-1α的累積及活化，并能抑制HIF-1α蛋白的降解，說明IRI中缺氧及TLR4激活可協同作用，增加HIF-1α的累積及活化，二者在大鼠肺缺血再灌注損傷的發生和發展過程中可能發揮著重要作用，但具體機制仍需做更深入研究。

本研究利用RT-PCR技術和Western-blot技術分別對各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白水平進行檢測發現，IRI模型組mRNA和蛋白水平均高于假手術組，而TLR4激活組更高，但TLR4抑制組mRNA和蛋白水平均明顯低于IRI模型組。TNF-α和IL-6作為促炎癥因子均可以誘導中性粒細胞趨化和其他炎癥因子的產生，導致缺血再灌注損傷的發生[18-19]。本研究發現，TLR4可上調TNF-α和IL-6等炎癥因子水平，促進炎性反應的發展，進而導致缺血再灌注損傷的加重。同時也表明，HIF-1α在TLR4信號通路介導的肺IRI中發揮著重要作用，其可上調繼發性損傷性因子等因素，促進細胞凋亡及炎性反應；而抑制TLR4激活通道后可明顯抑制HIF-1α的活性，進而降低各項炎癥因子水平，但能否將抑制HIF-1α的活性作為一種新的治療靶點仍需做進一步的深入研究。

本研究采用不同方式干預處理后制作大鼠肺IRI模型并檢測各項指標發現，脂多糖激活TLR4后可促進缺氧因子HIF-1α的分泌和表達，并能上調炎癥因子水平，促進炎性反應的發生和發展，進而導致肺IRI加重，這與相關文獻的結果基本一致[20]。但本研究限于研究樣本量不足，對于TLR4信號通路介導HIF-1α水平變化的具體機制仍需進一步深入研究。

綜上所述，大鼠肺IRI后肺組織中TLR4信號通路介導HIF-1α水平顯著升高，從而增加對肺組織的炎癥損傷程度。

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（收稿日期：2016-11-17 本文編輯：程 銘）