表沒食子兒茶素沒食子酸酯對同型半胱氨酸促血管平滑肌細(xì)胞增殖的保護(hù)作用

戰(zhàn)曉麗, 周東池, 顧惠芳, 楊秀紅, 金惠敏

(上海市浦東醫(yī)院 腎臟內(nèi)科, 上海, 201399)

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯對同型半胱氨酸促血管平滑肌細(xì)胞增殖的保護(hù)作用

戰(zhàn)曉麗, 周東池, 顧惠芳, 楊秀紅, 金惠敏

(上海市浦東醫(yī)院 腎臟內(nèi)科, 上海, 201399)

目的 觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在同型半胱氨酸(Hcy)促血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖中的保護(hù)作用。方法 采用不同的實驗試劑培養(yǎng)人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs), 分為對照組(control)、Hcy組(Hcy 100、200、500、1 000 μmol/L)、EGCG組(EGCG 5、10、20 μmol/L)、Hcy+EGCG組(Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L), 在培養(yǎng)的24 h, 采用CCK-8法、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記法觀察細(xì)胞增殖情況; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血管緊張素Ⅱ(AngII)濃度, Western印跡法測定AngII受體1(AT-1R)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 干預(yù)24 h后，與對照組相比, Hcy各組細(xì)胞增殖均顯著增加(P<0.05), EGCG 10、20 μmol/L組細(xì)胞增殖顯著減少(P<0.05); 與Hcy 500 μmol/L組相比，加入EGCG 10、20 μmol/L干預(yù)后細(xì)胞增殖顯著減少(P<0.01), AngII濃度及AT-1R蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。結(jié)論 EGCG可抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs增殖。

同型半胱氨酸; 表沒食子兒茶素沒食子酸酯; 增殖; 血管緊張素Ⅱ; 血管緊張素Ⅱ1型受體

流行病學(xué)調(diào)查[1-2]顯示，慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率越來越高，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。心血管疾病(CVD)是CKD患者的主要死因，嚴(yán)重影響CKD患者預(yù)后[3]。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是血管壁的主要組成成分，其過度增殖是CVD的重要危險因素[4-5], 而腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[6-7]。同型半胱氨酸(Hcy)作為CKD患者CVD的一種非傳統(tǒng)危險因素受到人們的關(guān)注，體外高Hcy狀態(tài)下培養(yǎng)VSMCs可促進(jìn)其增殖。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中的主要活性成分，其抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)效應(yīng)的研究是熱點。本研究觀察EGCG對Hcy促HASMCs增殖的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人主動脈血管平滑肌細(xì)胞株(HASMCs)由上海市復(fù)旦IBS細(xì)胞庫提供。胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。EGCG(純度≥95%)、Hcy(純度≥95%)、奧美沙坦(Olmesartan，純度≥98%)、4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自美國Sigma公司。CCK8試劑盒購自日本同仁(Dojindo)。BrdU、BrdU抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，紅色熒光Alexa fluor594購自美國thermo fisher scientific。人AngII ELISA試劑盒、抗AT-1R抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): HASMCs置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為4.5 g/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。在干預(yù)之前，將細(xì)胞置于含0.1%FBS培養(yǎng)基中饑餓24 h。

1.2.2 細(xì)胞增殖的檢測: ① CCK-8法。HASMCs常規(guī)培養(yǎng)后消化傳代，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×104/mL, 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板(每孔100 μL), 待細(xì)胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培養(yǎng)基饑餓24 h。換用不同試劑干預(yù)24 h(加入EGCG、Olmesartan或者二者預(yù)處理時，先加入上述相應(yīng)濃度的試劑孵育30 min, 再加入Hcy使其達(dá)到所需終濃度)，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕震搖培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h, 于450 nm測吸光度(OD值)。② BrdU標(biāo)記法: HASMCs常規(guī)培養(yǎng)后消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板(每孔1.0×104個細(xì)胞)，待細(xì)胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培養(yǎng)基饑餓24 h。加入不同試劑孵育，同時加入BrdU(終濃度為10 μmol/L)。干預(yù)24 h后, 4%多聚甲醛固定，加入2 mol/L的HCl室溫下放置1 h, 0.1 mol/L硼酸處理15 min, 0.1%Triton X-100通透2 min、10%BSA封閉1 h, 加入抗-BrdU抗體4 ℃過夜，再加入Alexa Fluor 594熒光二抗(顯示為紅色熒光，激發(fā)波590 nm/發(fā)射波617 nm)、室溫下孵育1 h, 以上各步之間均用PBS洗滌3次。最后DAPI染色10 min, PBS洗滌3次。顯微鏡下觀察并拍照，每組選取5個不同視野計數(shù)，計算LI(LI=BrdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))。③ ELISA測定AngII濃度: HASMCs常規(guī)培養(yǎng)后消化傳代，待細(xì)胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培養(yǎng)基饑餓24 h。換用Hcy+EGCG干預(yù)24 h, 收集細(xì)胞培養(yǎng)基4 ℃ 3 000×g離心10 min, 收集細(xì)胞上清液，分裝于EP管中, -20 ℃保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞上清液AngII的檢測使用人AngII ELISA試劑盒。④ Western印跡法測定AT-1R蛋白表達(dá)水平: HASMCs常規(guī)培養(yǎng)后消化傳代，待細(xì)胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培養(yǎng)基饑餓24 h。換用Hcy+EGCG干預(yù)24 h, 收集細(xì)胞常規(guī)提取蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 每孔上樣量為30 μg總蛋白)，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜, 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h, PVDF膜和所需抗體孵育4 ℃過夜, TBST洗3次，室溫孵育二抗1 h, TBST洗3次，化學(xué)發(fā)光顯影。所有實驗重復(fù)3遍，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 EGCG對HASMCs增殖的影響

2.1.1 CCK-8法：不同試劑干預(yù)24 h, 結(jié)果顯示，與對照組相比, Hcy組OD值均顯著增加(P<0.05), 且Hcy 500、1 000 μmol/L時OD值增加更顯著(P<0.01); 與對照組相比, EGCG 5 μmol/L組OD值無顯著下降(P>0.05), EGCG 10、20 μmol/L組OD值均顯著下降(P<0.05), 且EGCG 20 μmol/L時OD值下降更顯著(P<0.01); 與Hcy 500 μmol/L組相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干預(yù)后，其OD值均顯著下降(P<0.01)。在本實驗中，作者還加入了Olmesartan，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Hcy 500 μmol/L組相比, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L組OD值均顯著下降(P<0.01), 但前二者無顯著差異(P>0.05); 而與Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L組相比, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L組OD 值均顯著增加(P<0.05); 提示在Hcy誘導(dǎo)的VSMC增殖中, EGCG與Olmesartan均可抑制細(xì)胞增殖，且二者有疊加效應(yīng)。見表1。

2.1.2 BrdU標(biāo)記法：不同試劑干預(yù)24 h, 結(jié)果顯示，與對照組相比, Hcy組LI均顯著增加(P<0.05), 且Hcy 200、500、1 000 μmol/L時LI增加更顯著(P<0.01); 與對照組相比, EGCG 5 μmol/L組LI無顯著下降(P>0.05), EGCG 10、20 μmol/L組LI均顯著下降(P<0.01); 與Hcy 500 μmol/L組相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干預(yù)后，其LI均顯著下降(P<0.01)。作者也加入了Olmesartan, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Hcy 500 μmol/L組相比, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L +EGCG 20 μmol/L組LI均顯著下降(P<0.01), 但前二者無顯著差異(P>0.05); 與Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L組相比, Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L組LI顯著增加(P<0.05); 提示在Hcy誘導(dǎo)的VSMC增殖中, EGCG與奧美沙坦均可抑制細(xì)胞增殖，且二者有疊加效應(yīng)。見表2。

表1 HASMCs的增殖情況(OD值)

與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01;

與Hcy 500 μmol/L比較, ##P<0.01;

與Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG

20 μmol/L比較, △P<0.05。

表2 HASMCs的增殖情況(LI)

與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01;

與Hcy 500 μmol/L比較, ##P<0.01; 與Hcy 500 μmol/L+Olmesartan

1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L比較, △P<0.05。

2.2 EGCG對AngII濃度的影響

Hcy 500 μmol/L+不同濃度EGCG(Hcy 500 μmol/L+EGCG5 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L)干預(yù)24 h, 收集細(xì)胞上清液，ELISA法測定AngII濃度。結(jié)果顯示，與Hcy 500 μmol/L組相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干預(yù)后AngII濃度顯著降低(P<0.01), 但2組間無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

control是指對照組;Hcy、EGCG濃度均為μmol/L。與Hcy500μmol/L比較,**P<0.01圖1 EGCG對局部AngII濃度的影響

2.3 EGCG對AT-1R蛋白表達(dá)的影響

Hcy 500 μmol/L+不同濃度EGCG(Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L)干預(yù)24 h, 結(jié)果顯示，與Hcy 500 μmol/L組相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干預(yù)后AT-1R蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01), 但是2組間無顯著差異(P>0.05)。見圖2。

A: AT-1R、GAPDH的Western印跡條帶圖; B: AT-1R蛋白定量分析圖; control是指對照組; Hcy是指Hcy濃度為500 μmol/L; Hcy+EGCG5是指Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L; Hcy+EGCG 10是指Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L;Hcy+EGCG 20是指Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L。與Hcy 500 μmol/L比較, **P<0.01

圖2 EGCG對AT-1R蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

CVD是CKD患者主要并發(fā)癥之一，已成為CKD患者的主要死因，嚴(yán)重影響CKD患者的預(yù)后[3]。VSMCs是血管壁的主要成分，其過度增殖是CVD的重要因素[4- 5]。CKD患者發(fā)生CVD的危險因素有很多，除了傳統(tǒng)危險因素如吸煙、糖尿病、高血壓、高血脂等, Hcy作為一種非傳統(tǒng)危險因素越來越受到人們的關(guān)注[8-9]。

Hcy屬于甲硫氨酸的代謝中間產(chǎn)物，血漿Hcy范圍在5～10 μmol/L, 正常狀態(tài)下, Hcy濃度不超過15 μmol/L, 血漿Hcy水平升高定義為高同型半胱氨酸血癥(hHcy)[10]。CKD患者中普遍存在Hcy水平異常，據(jù)報道85%～90%CKD患者Hcy升高[9]。研究[11-12]表明, CKD患者中Hcy水平升高預(yù)示著心血管不良事件。Hcy水平升高引起CVD的發(fā)病機制目前并不十分清楚，認(rèn)為可能與以下幾方面有關(guān)：血管內(nèi)皮損傷及功能障礙、破壞凝血和纖溶平衡、脂質(zhì)代謝異常、促進(jìn)VSMCs增殖、免疫系統(tǒng)如單核細(xì)胞的激活等。其中，有關(guān)Hcy誘導(dǎo)VSMCs增殖的研究已引起越來越多學(xué)者的興趣。Tang等[13]報道, Hcy(500～1 000 μmol/L)孵育人臍動脈平滑肌細(xì)胞24 h后，可引起VSMCs增殖呈濃度依賴性增加。本研究發(fā)現(xiàn), Hcy(100、200、500、1 000 μmol/L)呈劑量依賴方式誘導(dǎo)VSMCs增殖, Hcy 500 μmol/L時其促增殖效應(yīng)達(dá)峰值。

綠茶是世界上最受歡迎的飲品之一，它具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在許多疾病防治方面發(fā)揮重要作用，如腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病、腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等[14]。研究[15-18]發(fā)現(xiàn)，大量攝入綠茶可明顯降低CVD風(fēng)險, EGCG作為綠茶的主要活性成分，對心血管系統(tǒng)具有重要的保護(hù)作用。EGCG可抑制VSMCs增殖，但是EGCG是否可抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs增殖及其相關(guān)機制目前仍未有研究。本實驗結(jié)果表明, EGCG(10、20 μmol/L)可抑制VSMCs增殖，且EGCG(10、20 μmol/L)可抑制Hcy 500 μmol/L誘導(dǎo)的VSMCs增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

CKD與CVD均與RAS有著密切關(guān)系。AngII是RAS中的重要成員之一，它與AT-1R結(jié)合后引起血管收縮、促進(jìn)細(xì)胞增殖、炎癥、氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)效應(yīng)。為了研究EGCG發(fā)揮作用是否與局部RAS有關(guān)，作者加入了AT-1R阻斷劑-奧美沙坦，再采用CCK-8和BrdU兩種方法觀察VSMCs增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Hcy 500 μmol/L組相比，加入奧美沙坦1 μmol/L阻斷AT-1R后，其OD值、LI均顯著下降(P<0.01)，而與Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L和Hcy 500 μmol/L+Olmesarsan 1 μmol/L組相比, Hcy 500 μmol/L+Olmesarsan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L組OD值、LI顯著下降(P<0.05), 提示EGCG與奧美沙坦均可抑制細(xì)胞增殖，二者發(fā)揮類似作用，且二者有疊加效應(yīng)。作者采用ELISA的方法測定VSMCs培養(yǎng)上清液中AngII的濃度，采用Western印跡法測定VSMCs中AT-1R蛋白表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，加入EGCG(10、20 μmol/L)干預(yù)后可抑制VSMCs分泌AngII, 可下調(diào)VSMCs中AT-1R蛋白表達(dá)水平，與Hcy 500 μmol/L組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

[1] Stauffer M E, Fan T. Prevalence of anemia in chronic kidney disease in the United States[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e84943.

[2] Zhang L, Wang F, Wang L, et al. Prevalence of chronic kidney disease in China: a cross-sectional survey[J]. Lancet, 2012, 379(9818): 815-822.

[3] Townsend R R, Taler S J. Management of hypertension in chronic kidney disease[J]. Nat Rev Nephrol, 2015, 11(9): 555-563.

[4] Ross R. Atherosclerosis—an inflammatory disease[J]. N Engl J Med, 1999, 340(2): 115-126.

[5] Lake A C, Bialik A, Walsh K, et al. CCN5 is a growth arrest-specific gene that regulates smooth muscle cell proliferation and motility[J]. Am J Pathol, 2003, 162(1): 219-231.

[6] Ferrario C M. Role of angiotensin II in cardiovascular disease therapeutic implications of more than a century of research[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2006, 7(1): 3-14.

[7] Bourmoum M, Charles R, Claing A. The GTPase ARF6 Controls ROS Production to Mediate Angiotensin II-Induced Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[J]. PLoS One, 2016, 11(1): e148097.

[8] Kendrick J, Chonchol M B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease[J]. Nat Clin Pract Nephrol, 2008, 4(12): 672-681.

[9] Jakovljevic B, Gasic B, Kovacevic P, et al. Homocystein as a risk factor for developing complications in chronic renal failure[J]. Mater Sociomed, 2015, 27(2): 95-98.

[10] Seshadri S, Beiser A, Selhub J, et al. Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and Alzheimer′s disease[J]. N Engl J Med, 2002, 346(7): 476-483.

[11] Buccianti G, Baragetti I, Bamonti F, et al. Plasma homocysteine levels and cardiovascular mortality in patients with end-stage renal disease[J]. J Nephrol, 2004, 17(3): 405-410.

[12] Heinz J, Kropf S, Luley C, et al. Homocysteine as a risk factor for cardiovascular disease in patients treated by dialysis: a meta-analysis[J]. Am J Kidney Dis, 2009, 54(3): 478-489.

[13] Tang L, Mamotte C D, Van Bockxmeer F M, et al. The effect of homocysteine on DNA synthesis in cultured human vascular smooth muscle[J]. Atherosclerosis, 1998, 136(1): 169-173.

[14] Chowdhury A, Sarkar J, Chakraborti T, et al. Protective role of epigallocatechin-3-gallate in health and disease: A perspective[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 78: 50-59.

[15] Young W, Hotovec R L, Romero A G. Tea and atherosclerosis[J]. Nature, 1967, 216(5119): 1015-1016.

[16] Tijburg L B, Mattern T, Folts J D, et al. Tea flavonoids and cardiovascular disease: a review[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 1997, 37(8): 771-785.

[17] Geleijnse J M, Launer L J, Van der Kuip D A, et al. Inverse association of tea and flavonoid intakes with incident myocardial infarction: the Rotterdam Study[J]. Am J Clin Nutr, 2002, 75(5): 880-886.

[18] Kuriyama S, Shimazu T, Ohmori K, et al. Green tea consumption and mortality due to cardiovascular disease, cancer, and all causes in Japan: the Ohsaki study[J]. JAMA, 2006, 296(10): 1255-1265.

Protective effects of epigallocatechin gallate on homocysteine-induced proliferation of vascular smooth muscle cells

ZHAN Xiaoli, ZHOU Dongchi, GU Huifang, YANG Xiuhong, JIN Huimin

(DepartmentofNephrology,ShanghaiPudongHospital,Shanghai, 201399)

Objective To observe the protective effect of epigallocatechin gallate (EGCG) on homocysteine-induced proliferation of human aortic smooth muscle cells (HASMCs). Methods HASMCs were served as objects, which were cultured in various media, including Hcy (100, 200, 500, 1 000 μmol/L), EGCG (EGCG 5, 10, 20 μmol/L), Hcy+EGCG (Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L, Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L) for 24 h. The proliferation of HASMCs was determined by cell counting kit-8 (CCK-8) and bromodeoxyuridine (BrdU) labeling. The level of angiotensin Ⅱ(AngII) was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the level of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT-1R) was determined by Western blot. Results After treatment for 24 h, compared with the control group, the proliferation of cells in different Hcy groups significantly increased (P<0.05), while the proliferation of cells in EGCG 10 and 20 μmol/L group significantly reduced (P<0.05). Compared with the Hcy 500 μmol/L group, cell proliferation significantly reduced after adding EGCG 10 and 20 μmol/L (P<0.01), while the expression levels of AngII and AT-1R decreased significantly (P<0.01). Conclusion EGCG can inhibit Hcy-induced proliferation of VSMCs.

homocysteine; epigallocatechin gallate; proliferation; angiotensinII; angiotensin Ⅱ type 1 receptor

2017-01-22

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)資助項目(PWRq2014-05);

金惠敏

R 654.3

A

1672-2353(2017)13-017-05

10.7619/jcmp.201713005

上海市醫(yī)學(xué)重點專科建設(shè)項目(ZK2015A15); 上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學(xué)科建設(shè)項目(PWZx2014-11);

上海市浦東新區(qū)醫(yī)學(xué)領(lǐng)先人才項目(PWRI2012-05)