幽門螺桿菌細胞毒素相關蛋白A、細胞毒素相關蛋白E、細胞空泡毒素A基因型與上消化道疾病的關系

蔣閔仁, 黃 英, 宋佳鴻, 葉圓圓

(1. 同濟大學附屬第十人民醫院 消化內科, 上海, 200072;2. 民航上海醫院-瑞金醫院古北分院消化內科, 上海, 200336)

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幽門螺桿菌細胞毒素相關蛋白A、細胞毒素相關蛋白E、細胞空泡毒素A基因型與上消化道疾病的關系

蔣閔仁1, 黃 英2, 宋佳鴻1, 葉圓圓1

(1. 同濟大學附屬第十人民醫院 消化內科, 上海, 200072;2. 民航上海醫院-瑞金醫院古北分院消化內科, 上海, 200336)

目的 分析幽門螺桿菌(Hp)的細胞毒素相關蛋白A(cagA)、細胞毒素相關蛋白E(cagE)、細胞空泡毒素A(vacA)基因型與上消化道疾病的關系。方法 選取112例上消化道疾病患者，對其胃黏膜組織中Hp菌株的cagA、cagE、vacA基因型進行檢測和分析。結果 所有患者胃黏膜樣本中的Hp菌株均為cagA基因和cagE基因陽性表達，陽性率均為100%。患者的vacA s1/m2表型的陽性率最高，分別為54.1%和60.5%, 其次為vacA s1/mlb表型和vacA s1/m-表型，陽性率分別為13.2%～21.1%。消化性潰瘍患者和慢性胃炎患者的Hp基因各表型的陽性率的差異均無統計學意義(P>0.05)。結論 上消化道疾病患者胃黏膜組織中的Hp菌株呈現cagA、cagE、vacA s1/m2等基因亞型的優勢表達，說明這些毒力因子表型在Hp引發和促進上消化道疾病的過程中具有重要的作用，但與上消化道疾病類型缺乏相關性。

幽門螺桿菌; 細胞毒素相關蛋白A; 細胞毒素相關蛋白E; 細胞空泡毒素A; 基因分型; 上消化道疾病

幽門螺桿菌(Hp)于1983年首次從胃黏膜組織中分離，相關流行病學調查數據顯示，全世界人群中有近50%感染Hp。大量研究[1]證實，Hp感染是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃MALT淋巴瘤、結直腸腫瘤、反流性食管炎等多種消化道疾病的致病因素之一。研究[2]還揭示Hp感染與心腦血管疾病、血液系統疾病、神經系統疾病等多種胃腸外疾病的相關性。Hp具有多種毒力因子，主要包括尿素酶、黏液酶、磷脂酶A、溶血素、細胞毒素相關蛋白A(cagA)和細胞空泡毒素A(vacA)等。近年來針對Hp菌株基因分型的研究[3]證實，Hp基因型的差異可導致不同毒性作用，從而導致臨床療效和預后的顯著不同。因此，針對Hp基因型的識別和研究對于各種上消化道疾病的防治具有重要的意義。在Hp各類致病因子基因分型中，cagA、cagE、vacA基因分型是影響Hp致病性的重要因素[4]。本研究分析Hp菌株的cagA、cagE、vacA基因型與上消化道疾病的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2016年6月在醫院就診的慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍患者112例作為研究對象，其中消化性潰瘍74例，慢性胃炎38例，均經胃鏡下胃黏膜組織活檢確診。其中男61例，女51例，年齡為28～56歲，平均年齡為(42.1±6.8)歲。排除入組前15 d內應用過質子泵抑制劑、非甾體消炎藥的患者，排除長期酗酒的患者，排除具有胃切除術史的患者，排除合并有重要器官器質性病變、心肝腎功能不全的患者。所有納入患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

所有患者均于胃鏡下鉗取胃黏膜組織進行Hp快速尿素酶檢測，并根據結果再次鉗取胃黏膜進行Hp培養和病理檢查，采樣位置位于幽門部位5 cm處。Hp培養所得菌落經洗滌后，以8 000 r/min的速度離心5 min。提取DNA后采用PCR反應系統進行擴增，引物系列、反應體系、反應條件見表1, 擴增產物采用瓊脂凝膠電泳在紫外燈下進行分析。PCR反應體系: 上游引物0.5 μL, 下游引物0.5 μL, PCR緩沖液2 μL, dNTPs 1.6 μL, TaqDNA聚合酶0.2 μL, 模板DNA 1 μL, 去離子水14.2 μL, 合計20 μL。PCR反應條件: 預變性94 ℃ 5 min, 變性94 ℃ 1 min, 退火55 ℃ 1 min, 延伸72 ℃ 6 min。

表1 目的基因的引物序列

1.3 統計學方法

應用SPSS 18.0 for Windows統計軟件進行統計學分析，計數資料采用百分比的形式表示，采用卡方檢驗進行處理，均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

本組患者中，所有患者胃黏膜樣本中的Hp菌株均為cagA基因和cagE基因陽性表達，陽性率均為100%。在vacA基因表型中，消化性潰瘍患者和慢性胃炎患者的vacA s1/m2表型的陽性率最高，分別為54.1%和60.5%, 其次為vacA s1/mlb表型和vacA s1/m-表型，陽性率分別為13.2%～21.1%, 而其他表型的陽性率均較低，兩類患者的Hp基因各表型的陽性率的差異均無統計學意義(χ2=0.400～1.965,P>0.05)，見表2。

表2 112例消化道疾病患者的Hp基因表達情況

3 討 論

本研究結果顯示，上消化道疾病患者胃黏膜中的Hp菌株全部為cagA基因和cagE基因陽性表達, vacA s1/m2的陽性率最高，其次為vacA s1/mlb表型和vacA s1/m-表型，但不同類型上消化道疾病患者的Hp基因各表型的陽性率差異并不明顯，這體現了cagA、cagE、vacA s1/m2等Hp致病因子表型在Hp引發上消化道疾病的過程中均發揮著重要的作用，但在不同類型的上消化道疾病中并不存在顯著差異。Hp菌株的cagA能夠通過Ⅳ型分泌系統進入宿主細胞，通過對EMT相關的信號通路分子、miRNA-584、miRNA-1290等基因表達水平進行調節，從而調控胃上皮細胞形態、細胞間連接以及細胞凋亡等細胞相關生物學行為，最終導致胃黏膜組織的損害甚至是惡變，而cagA是由cagA基因編碼產生[5-6]。

近年來的研究結果顯示, Hp菌株的cagA表達水平及基因表型與上消化道疾病的發病具有相關性。馬瑛澤等[7]的研究結果顯示，胃十二指腸疾病Hp陽性感染者的cagA表達陽性率均明顯高于健康對照人群, cagA的陽性表達與胃炎、胃十二指腸潰瘍等疾病的發生密切相關。陳周利[8]的研究證實, cagA表達陽性的Hp感染上消化道疾病患者的血清IL-9水平要顯著低于cagA表達陰性的患者，而IL-9可能對Hp感染所致的胃黏膜損害發揮抑制作用。謝兆蘭等[9]的研究結果顯示，Hp菌株cagA表達陽性的慢性胃炎患者的胃黏膜炎癥程度更重，與cagA表達陰性的患者比較，此類患者的外周血中細胞因子IFN-γ、IL-17A等表達水平顯著下降，而IL-4、TGF-β的表達水平顯著上升。郭皓等[10]的研究結果顯示, cagA表達陽性的Hp感染患者的血清IL-6、IL-8水平更高，cagA基因型與IL-6、IL-8有密切關系。羅昭遜等[11]的研究結果顯示，對于甲硝唑耐藥的Hp菌株的cagA基因陽性率為100%, 而且cagA基因在某些位點上存在共同突變，同時還具有較多的隨機突變位點, cagA基因陽性是導致耐甲硝唑Hp菌株出現的主要原因之一。但郎軼萱等[12]的報道則顯示, Hp耐藥菌株與cagA表達陽性并不存在明顯的相關性。vacA因能夠導致胃上皮細胞空泡化而得名，隨著針對其毒力作用的研究深入, vacA已被證實可引發促分裂原活化蛋白激酶激活、質膜通透性增加、極化上皮單層屏障功能下降、細胞凋亡增加、免疫功能紊亂等胃上皮細胞多重病理改變，但在有毒力的Hp菌株中vacA的轉錄水平和作用效能均存在著較大的差異，這與vacA基因的多態性具有密切的相關性[13]。楊卓等[14]的研究結果顯示，VacA N端片段可誘導GES-1細胞凋亡及空泡樣變，而VacA蛋白則可通過這一途徑激活Caspase-9和Caspase-3從而發揮細胞損傷作用。田一玲等[15]的研究結果顯示, Hp菌株對阿莫西林耐藥與VacA基因型具有相關性。牛省利等[16]的研究證實，Hp菌株VacA m區基因型與胃潰瘍患者對蘭索拉唑三聯療法的反應性有關，能夠作為預測治療結局參考指標。

近年來，不少研究者針對Hp菌株的cagA、cagE、vacA基因分型情況進行了調查和監測，但結果并不完全一致。杜東龍等[17]針對威海地區臨床分離Hp菌株的cagA基因的3′端多態性進行了監測，結果顯示，威海地區的Hp cagA基因以東亞型為主，東、西方亞型Hp菌株都存在cagA基因3′端編碼氨基酸序列的改變。張忠等[18]的研究結果顯示，vac A s1/m2亞型是與慢性萎縮性胃炎相關Hp毒力菌株。姜成等[19]的研究結果顯示，慢性胃痛患者的Hp菌株vacA基因以s1/m2亞型為主，而該類型Hp菌株感染增加了NF-κB P65蛋白的表達。戚艷麗等[20]針對洛陽地區Hp菌株的vacA基因亞型進行了監測和研究，結果顯示，洛陽地區感染Hp的VacA陽性率近50%, 優勢基因亞型為s1/m2, 但vacA亞型及亞型嵌合體的陽性率在不同胃腸疾病之間并不存在顯著差異。胡素俠等[21]針對淮南地區Hp感染的個體菌株基因多態性及其對感染結局的影響進行了研究，結果顯示，cagA表達陽性、vacAs表達陽性、iceA2表達陽性為淮南地區Hp感染的優勢基因型，該基因型會增加Hp根除失敗的風險。張雙紅等[22]針對江西地區胃十二指腸疾病兒童感染的臨床分離Hp菌株的cag A、vac A和ice A基因亞型的研究結果顯示，該地區胃十二指腸疾病患兒感染的Hp優勢基因亞型是cagA、vacA s1/m2和ice A1，而且存在不同基因型HP菌株的混合感染，但Hp基因亞型與胃十二指腸疾病類型無相關性。阿孜爾古麗·阿布都克日木等[23]對新疆維吾爾族和漢族患者的Hp分離株cagA、vacA基因型與上消化道疾病的相關性進行了分析，研究結果顯示，維吾爾族胃癌患者的vacA m2基因型檢出率顯著高于漢族患者，而vacA m1b基因型檢出率則較低，兩個民族研究對象的vacA m1b基因型檢出率從高到低的排列次序均為慢性胃炎、胃潰瘍和胃癌。秦丹等[24]針對貴陽地區兒童Hp感染臨床分離菌株的cagA基因和vacA基因表達研究結果顯示，該地區兒童HP感染菌株的cagA基因陽性率超過了80%，vacA基因亞型的優勢基因為vacA s1/m2型，但毒力基因與疾病的種類和Hp針對阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星等抗菌藥物的耐藥性增強均無明顯的相關性[25-27]。總之，不同地區和種族的Hp菌株的毒力因子基因表型存在著一定的差異，但其基因表型與疾病種類、耐藥性的相關性尚需進一步的臨床研究予以討論。

綜上所述，上消化道疾病患者胃黏膜組織中的Hp菌株呈現cagA、cagE、vacA s1/m2等基因亞型的優勢表達，說明這些毒力因子表型在Hp引發和促進上消化道疾病的過程中具有重要的作用，但與上消化道疾病類型缺乏相關性。

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Relationship between cytotoxic associated protein A,cytotoxic associated protein E, vacuolating cytotoxin A genotypes of Helicobacter pylori and upper digestive tract diseases

JIANG Minren1, HUANG Ying2, SONG Jiahong1, YE Yuanyuan1

(1.DepartmentofDigestiveMedicine,TheTenthPeople′sHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai, 200072; 2.DepartmentofDigestiveMedicine,TheGubeiBranchofRuijinHospital,Shanghai, 200336)

Objective To explore the relationship between cytotoxin associated protein A (cagA), cytotoxin associated protein E(cage), vacuolating cytotoxin A (vacA) genotypes of Helicobacter pylori (Hp) and the upper digestive tract diseases. Methods A total of 112 patients with upper gastrointestinal diseases were selected. The cagA, cagE, vacA genotypes of Hp strains in gastric mucosa of the patients were detected and analyzed. Results All Hp strains in the gastric mucosa samples of patients were found with both cagA gene and cagE gene expression, and the positive rate was 100%. The positive rates of vacA s1/m2 genotype in the patients were the highest with 54.1% and 60.5% respectively, followed by the vacA s1/mlb genotype and vacA s1/m- phenotypes, and the positive rates were from 13.2% to 21.1%. The differences of positive rates of each genotypes in Hp genes between the patients with peptic ulcer and chronic gastritis were not significant (P>0.05). Conclusion Hp strains in gastric mucosa patients with upper gastrointestinal diseases show the advantage expressions of cagA, cagE, vacA s1/m2 subtypes, which refers that such virulence phenotypes may play important roles in initiation and promotion process of upper gastrointestinal diseases by Hp, but the correlation with the type of upper digestive tract diseases is not proved.

Helicobacter pylori; cytotoxic associated protein A; cytotoxic associated protein E; vacuolating cytotoxin A; genotypes; upper gastrointestinal diseases

2017-03-11

黃英, E-mail: 524370434@qq.com

R 573

A

1672-2353(2017)13-036-04

10.7619/jcmp.201713010