細胞破壁對螺旋藻藻藍蛋白提取效果的影響

俞建峰

傅 劍1,2

馬 瀟1,2

崔政偉1,2

(1. 江南大學機械工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

細胞破壁對螺旋藻藻藍蛋白提取效果的影響

俞建峰1,2

傅 劍1,2

馬 瀟1,2

崔政偉1,2

(1. 江南大學機械工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

螺旋藻細胞破壁是藻藍蛋白提取的關鍵工序。采用溶脹法、超細剪切法、超聲波法、反復凍融法、溶脹—超細剪切法和溶脹—超細剪切—超聲波法對螺旋藻細胞進行破壁處理；通過對比分析破壁后提取液中的藻藍蛋白得率來評價破壁方法的優劣。結果表明，溶脹法、超細剪切法、超聲波法、反復凍融法、溶脹—超細剪切法、溶脹—超細剪切—超聲波法得到的最高藻藍蛋白得率分別為8.90%，7.38%，8.00%，8.26%，9.22%，8.88%。綜合考慮，溶脹—超細剪切法相對其它5種破壁方法而言，其操作簡單便捷，破壁效果更加顯著，藻藍蛋白得率高；溶脹—超細剪切法最佳的提取工藝為：溶脹時間12 h，剪切時間5 min。

螺旋藻；藻藍蛋白；細胞破壁；提取

螺旋藻(SpirulinaPlatensis)是一種絲狀原核多細胞藻類，體長200～500 μm，寬5～10 μm，圓柱形，呈螺旋彎曲狀。螺旋藻主要包含鈍頂螺旋藻(S.Platensis)、極大螺旋藻(S.Maxim)和鹽澤螺旋藻(S.Subsalsa)3種。螺旋藻內部富含藻藍蛋白、葉綠素、胡蘿卜素及不飽和脂肪酸等多種生物活性成分[1]，營養豐富，總蛋白質含量高達55%～65%[2]。

藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是一種重要的營養豐富的捕光色素蛋白，具有強烈的熒光性，常被制成生物探針用于成分含量檢測[3]；藻藍蛋白內氨基酸組成成分齊全，必需氨基酸含量高，具有抗癌[4-5]、抗氧化[6-8]、提高生理機能等多種生理功能。近年來藻藍蛋白在生物醫療[9]和食品方面[10]的應用研究正在不斷拓展深入，所以藻藍蛋白的提取分離成為時下技術工程研究的一大熱門方向。

現階段螺旋藻藻藍蛋白的提取方法種類繁多，然而至今仍沒有相關文獻提出一種成熟穩定的提取方法，所以藻藍蛋白的提取研究仍處于創新發展階段[11]。螺旋藻藻藍蛋白提取的關鍵技術在于細胞破壁和分離純化，因此細胞破壁技術是蛋白提取的關鍵工藝技術之一[12]。目前常用的細胞破壁技術有溶脹法[13]、反復凍融法[14]、超聲波法[15]、珠磨法[16]等，且無相關文獻公開提及到超細剪切細胞破壁方法。本試驗擬以鈍頂螺旋藻為研究對象，通過比較溶脹法、超細剪切法、超聲波法、反復凍融法、溶脹—超細剪切法、溶脹—超細剪切—超聲波法等細胞破壁方法對螺旋藻藻藍蛋白提取效果的影響，篩選出一種提取效率高、提取時間短、能耗低的細胞破壁方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻干粉：西安禾一生物技術有限公司；

硫酸銨：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

臺式離心機：TGL-16C型，上海安亭科學儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV1800型，日本島津公司；

精密電子天平：ARB120型,奧豪斯國際貿易(上海)有限公司；

超聲波細胞粉碎機：JY99-IIDN型,寧波新芝科技股份有限公司；

食品超細剪切機：HFX280B型，南昌贛康寶工貿有限公司；

電熱恒溫水槽：DK-80型，上海三發科學儀器有限公司；

冰箱：BCD-300WJ型，LG集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 藻藍蛋白濃度及得率 藻藍蛋白的濃度[17]和得率[18]計算：

(1)

(2)

式中：

Pc——藻藍蛋白濃度，mg/mL；

Y——藻藍蛋白的得率，%；

A620——樣品在波長為620 nm處的吸光度；

A652——樣品在波長為652 nm處的吸光度；

V——藻藍蛋白粗提取液體積，mL；

n——稀釋倍數；

DB——螺旋藻粉重量，g。

1.2.2 溶脹法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)[19-20]加入pH =7的磷酸緩沖液[21]，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環境下保存。在溶脹1，2，3，5，6，12，24，48，72 h后分別提取1/9的液體進行離心處理(15 000 r/min，15 min)，取離心上清液，加入一定量的飽和度為20%的硫酸銨溶液進行鹽析[22]。靜置一段時間對鹽析液進行離心處理，取沉淀，利用磷酸緩沖液溶解沉淀，得到的溶解液便是最終提取的藻藍蛋白溶液。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.3 超細剪切法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環境下保存4 h[23]。低溫溶脹4 h后將溶脹液分成7等份，用食品超細剪切機分別處理1，2，3，4，6，8，10 min。超細剪切的過程當中由于物料之間的碰撞會產生一定的熱量，為防止蛋白質變性，此處采用間歇式工作方法，如剪切30 s，停止30 s。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.4 超聲波法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環境下保存4 h。低溫溶脹4 h后將溶脹液分成6等分，用超聲波細胞粉碎機分別處理2，4，6，8，10，12 min，超聲波功率為90 W。由于超聲波處理的過程當中會產生一定的熱量，為防止蛋白質變性，此處采用間歇式工作方法，如工作2 s，停止5 s。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.5 反復凍融法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于-20 ℃的低溫環境中進行冷凍處理。溶液凍結實后取出，進行37 ℃水浴加熱處理[24]，取溶液的1/5進行離心處理(15 000 r/min，15 min)，剩余溶液繼續做凍融處理，總共5次。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.6 溶脹—超細剪切法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環境下保存。在溶脹4，8，12，24 h后分別提取1/4的溶液，將每份溶液又分成3等分，等分后的溶液用食品超細剪切機分別處理5，10，15 min。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.7 溶脹—超細剪切—超聲波法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環境下保存。在溶脹4，8，12，24 h后分別提取1/4的溶液，等分后的溶液用食品超細剪切機分別處理5 min。提取剪切后的溶液，用超聲波細胞粉碎機分別處理5 min，對超聲波處理后的溶液進行離心處理(15 000 r/min，15 min)，取離心上清液。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

2 結果與分析

2.1 溶脹法對藻藍蛋白得率的影響

溶脹法對藻藍蛋白得率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著溶脹時間的延長，藻藍蛋白得率呈先增加后逐漸穩定的趨勢，溶脹時間為24 h時，藻藍蛋白得率達到8.9%，且溶脹6 h時藻藍蛋白得率就已達到8.08%，接近藻藍蛋白得率的穩定值。綜合分析可知，溶脹時間對螺旋藻細胞破壁具有一定的影響，且溶脹24 h后的破壁效果相對更加明顯，但是考慮到工廠實際生產情況，溶脹時間一般選用4～8 h。

圖1 溶脹時間與藻藍蛋白得率的關系Figure 1 Relationship between swelling time and yield of phycocyanin

2.2 超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響

超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響見圖2。

圖2 剪切時間與藻藍蛋白得率的關系Figure 2 Relationship between ultrafine shearing time and yield of phycocyanin

由圖2可知，隨著剪切時間的延長，藻藍蛋白得率先不斷增加后趨于穩定，且剪切時間為8 min時，藻藍蛋白得率達到最大值7.38%。前3個取樣點出現的V型曲線，可能是剪切生熱導致蛋白質變性的影響大于超細剪切破壁的影響，隨著剪切時間不斷延長，超細剪切破壁成為影響藻藍蛋白得率的主要因素。9 min之后曲線出現略微下降，可能是剪切時物料之間的相互運動產生了一定的熱量，導致小部分蛋白失活。由此可知，超細剪切對藻藍細胞的破壁效果影響較大，試驗中最低得率值為3.79%，但是僅僅經過了6～8 min的剪切處理，得率上升到了7.38%，增幅較大。綜上分析，超細剪切破壁的方法效率比較高，對工業生產具有一定的潛在價值。

2.3 超聲波法對藻藍蛋白得率的影響

超聲波法對藻藍蛋白得率的影響見圖3。

由圖3可知，超聲時間為2 min時，藻藍蛋白的得率達到最大值(8.0%)。當曲線達到另一個極值點(超聲時間為8 min，得率為7.97%)時，得率開始急劇降低，可能是超聲產生的高溫導致溶出的蛋白質失活[25]。超聲時間在0～8 min時，超聲波產生的空穴效應使得螺旋藻細胞破裂，藻藍蛋白溶解到緩沖液中。超聲時間在8 min之后，超聲產生的熱量導致一部分蛋白質變性，曲線整體急劇下降。綜上所述，超聲波破壁效果較好，但是超聲過程中產生的熱量對藻藍蛋白得率的影響較大，且難以精確控制，因此需要進一步研究才能真正應用于工業生產。

圖3 超聲時間與藻藍蛋白得率的關系Figure 3 Relationship between ultrasonic time and yield of phycocyanin

2.4 反復凍融法對藻藍蛋白得率的影響

反復凍融法對藻藍蛋白得率的影響見圖4。

圖4 凍融次數與藻藍蛋白得率的關系Figure 4 Relationship between freezing-thawing times and yield of phycocyanin

由圖4可知，隨著凍融次數的增加，藻藍蛋白得率不斷升高，而且在反復凍融4次之后，破壁效果最佳，此時藻藍蛋白得率達到了8.26%。反復凍融處理1～3次時，對藻藍蛋白提取效果的影響不大；處理4次時，藻藍蛋白得率顯著增加；處理5次時，藻藍蛋白的得率出現略微下降，可能是溫度反復快速的變化導致蛋白質變性[26]。采用凍融法螺旋藻細胞破壁，需要在超低溫的環境進行下，所以難以應用到工業大規模生產中，現階段主要是實驗室小規模試驗，因此真正的投入使用還需要技術的進一步提升改進。

2.5 溶脹—超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響

溶脹—超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響見圖5。

由圖5可知，在溶脹時間為4 h或8 h的條件下進行螺旋藻細胞破壁處理，藻藍蛋白得率均呈上升趨勢，且當溶脹時間為8 h時，剪切時間為15 min，藻藍蛋白得率達到8.9%，與溶脹時間為12 h時藻藍蛋白得率的水平接近。在溶脹時間為12 h的條件下，藻藍蛋白得率隨剪切時間的變化基本一致，而且出現略微的下降。可能是溶脹時間太長，溶脹12 h后螺旋藻內的藻藍蛋白基本已經溶出，而且此時進行超細剪切并沒有起到破壁的作用，更多的是產生的熱量導致蛋白質變性。基于以上分析，溶脹和超細剪切協同作用對螺旋藻細胞破壁的影響較大，可以大大縮短溶脹時間，從而減少整個提取過程所消耗的時間，對工業化生產具有一定的指導意義。

圖5 溶脹時間和剪切時間協同作用與藻藍蛋白得率的關系Figure 5 Relationship of interactions of swelling time and ultrafine shearing time on yield of phycocyanin

2.6 溶脹—超細剪切—超聲法對藻藍蛋白得率的影響

溶脹—超細剪切—超聲法對藻藍蛋白得率的影響見圖6。

圖6 溶脹—超細剪切—超聲法中溶脹時間與 藻藍蛋白得率的關系

Figure 6 Relationship of swelling time and yield of phycocyanin based on the method of swelling-ultrafine shearing-ultrasonication

由圖6可知，溶脹4 h，超細剪切處理5 min，超聲波處理5 min，藻藍蛋白得率為7.72%。從圖1可知，在溶脹4 h時，藻藍蛋白得率大約為6%；從圖2可知，溶脹4 h，超細剪切處理5 min，藻藍蛋白得率大約為6.8%。根據以上分析知，溶脹—超細剪切—超聲法應用于螺旋藻細胞破壁中，在相同溶脹時間條件下，其破壁效果比溶脹法和超細剪切法要好。

2.7 不同細胞破壁方法的對比

細胞破壁方法對藻藍蛋白得率的影響見表1。

表1 不同細胞破壁方法作用下藻藍蛋白得率的比較Table 1 Comparison on yield of phycocyanin of cell disruption methods

通過對6種破壁方法進行對比分析，可以得出溶脹—超細剪切法在本試驗中的提取效果最好，藻藍蛋白得率最大為9.22%；同時溶脹法得到的藻藍蛋白得率最大為8.9%，超聲波法得到的藻藍蛋白得率為8.0%，溶脹—超細剪切—超聲波法得到的藻藍蛋白得率為8.88%；以上3種破壁方法的效果基本一致，但是溶脹法得到藻藍蛋白得率是在溶脹24 h的條件下得到的，時間消耗比較長；超聲波法得到藻藍蛋白得率是在溶脹4 h和超聲處理2 min的條件下得到的，消耗時間和能耗均比較少；溶脹—超細剪切—超聲波法得到藻藍蛋白得率是在溶脹12 h，超細剪切處理5 min和超聲波處理5 min的條件下得到的，消耗時間和能耗相對較多；反復凍融4次得到的藻藍蛋白得率為8.26%，相對也比較高，但是其時間消耗和能耗也較大。采用溶脹12 h及超細剪切5 min可獲得良好的螺旋藻細胞破壁效果。

3 結論

通過對比分析，溶脹—超細剪切法在本試驗中的細胞破壁效果最好，藻藍蛋白得率達到9.22%；溶脹法存在生產周期長，超聲波法和溶脹—超細剪切—超聲波法在運行中超聲波能量轉化為熱量造成蛋白變性，反復凍融法能耗高且耗時，這些細胞破壁方法的缺點使得工業化應用存在技術瓶頸。因此，溶脹—超細剪切法可以作為一種新型的螺旋藻細胞破壁方法。

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Comparison of cell disruption methods for the extraction of Phycocyanin fromSpirulinaPlatensis

YUJian-feng1,2

FUJian1,2

MAXiao1,2

CUIZheng-wei1,2

(1.MechanicalEngineeringSchool,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.JiangsuKeyLaboratoryofAdvancedFoodManufacturingEquipment&Technology,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The cell disruption is an important step during the extraction of phycocyanin fromSpirulinaPlatensis. Six methods including swelling, ultrafine shearing, ultrasonication, freezing and thawing, swelling-ultrafine shearing and swelling-ultrafine shearing-ultrasonication were applied to break the cell-wall ofS.plarensis. The effects of differentwall-broken methods were evaluated based on the the yield of the phycocyanin. The yield rates of phycocyanin extraction were 8.90%, 7.38%, 8.0%, 8.26%, 9.22%, 8.88%, Respectively,by using the swelling, ultrafine shearing, ultrasonication, thawing and swelling, swelling-ultrafine shearing, swelling-ultrafine shearing-ultrasonication. Finally, the swelling-ultrafine shearing was considered as the best way to break the wall, with swelling for 12 h and the shearing for 5 min.

SpirulinaPlatensis; phycocyanin; cell disruption; extraction

中央高校基本科研業務費專項(編號：JUSRP51634B)；江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室開放課題(編號：FM-2015-09)

俞建峰(1974—)，男，江南大學副教授，博士。 E-mail:robotmcu@126.com

2016—09—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.035