MicroRNA?31在膠質瘤中的表達及功能研究

侯文仲，毛振敏，曾敏敏，關北漩，廖國民，陳向林

［廣州醫科大學第六附屬醫院（清遠市人民醫院）神經外科，廣東 清遠 511518］

MicroRNA?31在膠質瘤中的表達及功能研究

侯文仲，毛振敏，曾敏敏，關北漩，廖國民，陳向林

［廣州醫科大學第六附屬醫院（清遠市人民醫院）神經外科，廣東 清遠 511518］

目的：探討MicroRNA?31在膠質瘤中的作用．方法：利用realtime?PCR檢測不同來源的膠質瘤組織和膠質瘤細胞中microRNA?31（miR?31）的表達，分析miR?31表達與膠質瘤級別的關系；MTT檢測 miR?31對膠質瘤細胞增殖的影響．結果：miR?31在膠質瘤組織和細胞中都是低表達的，且在膠質瘤組織中其表達水平隨著膠質瘤級別的升高而降低．在U87和U251中，miR?31均能抑制膠質瘤細胞的增殖，而同時加入antisense RNA抑制miR?31作用后細胞增殖即恢復．結論：MiR?31能夠抑制膠質瘤細胞的增殖，可能成為未來膠質瘤治療的新靶點．

MicroRNA?31；膠質瘤；惡性；增殖；治療靶點

0 引言

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見、預后較差的原發性惡性腫瘤．由于神經膠質瘤呈侵潤性生長，與腦組織無明顯分界，難以做到全部切除，僅通過傳統手術無法有效治愈，多主張聯合治療，配以化療和放療延緩復發和延長生存期［1－4］．由于現有的腫瘤藥物和放療多針對生長期細胞，對靜止狀態的神經膠質瘤干細胞沒有明顯的殺傷效果，導致侵潤性極強的神經膠質瘤具有高復發、低治愈的特點，是細胞生物學和神經生物學面臨的一大難題，因此尋找新的膠質瘤治療靶標是膠質瘤臨床治療的迫切需要［5－6］．

MicroRNA（miRNA）是一類含量豐富的非蛋白編碼（non?protein?coding）小RNA，可作為負性基因調節器調節多種生物進程［7－8］．生物信息數據顯示，每個miRNA能影響數百種基因的表達，miRNA可能對每一條遺傳通路都有影響［9］．研究發現MicroRNA?31（miR?31）在多種腫瘤中表達異常，如口腔癌、乳腺癌等，其在不同腫瘤中的功能也有所不同．有研究發現miR?31作用可能與其內源表達相關，如在乳腺癌中的miR?31的異常表達與乳腺癌細胞的惡性轉移相關．在作用機制方面，有部分研究提示miR?31可能參與調控細胞周期、表觀遺傳學修飾等．雖然關于miR?31在腫瘤中的功能有很多研究，但是其在膠質瘤中的表達和作用機制尚不明確．本研究分析了miR?31在膠質瘤細胞中的表達情況，發現miR?31在膠質瘤細胞的表達低于正常腦細胞．功能實驗發現miR?31抑制了膠質瘤的生長，其作用的分子機制仍在繼續研究中．

1 材料和方法

1．1 組織標本和細胞培養 收集廣州醫科大學第六附屬醫院2010～2015年間膠質瘤手術切除膠質瘤標本．納入標準：診斷經病理學檢查證實；手術患者術前未行化療或放療．所有標本獲取均經過倫理委員會審核批準．人神經膠質瘤細胞系 U251MG和U87MG 2012年購自中國科學院細胞細胞庫，正常膠質細胞系A172、T98和HEB購自北京創聯生物科技公司（中國，北京）．細胞系真實性均經過短串聯重復序列驗證．所有細胞均用高糖DMEM（Invitrogen公司，美國），添加 10%的胎牛血清（GIBCO公司，美國）、100 U／mL的青霉素（NCPC公司，中國）和100 μg／mL的鏈霉素（NCPC公司，中國），培養環境為含5%CO2的37°C細胞培養箱．

1．2 轉染 MicroRNA?31 mimics（sense：5'?CGGCAA GAUGUGGCAUAGC?3'，antisense：5'?TGCUTUGCCA GAUGUUGCC?3'）由 Invitrogen（上海）合成，陰性對照RNA duplexes購自Ambion（USA）．細胞按2×105鋪板于6孔細胞培養板中，待生長至密度為70%時轉染細胞，轉染試劑為Lipofeatmin2000，均按說明書操作．

1．3 qRT?PCR 通過實時熒光定量 PCR（qRT?PCR）檢測miR?31在神經膠質瘤細胞、神經膠質瘤組織和創傷性腦損傷組織中的表達水平．按照試劑盒操作規程使用Trizol（Invitrogen公司，美國）從凍存的組織樣品和細胞中抽提總RNA．RNA用不含RNase的DNase處理（羅氏公司，瑞士）．然后使用BcaBe?stRNA PCR試劑盒（TAKAR公司，中國）來合成cDNA．所有引物都由上海生工生物科技有限公司合成，熒光定量PCR使用SYBR底物，使用iQ5實時PCR檢測系統（Bio?Rad公司）檢測信號．引物序列為：5'?GGAGAGGAGGCAAGATGCTG?3'，5'?GGAAA GATGGCAATATGTTG?3'．

1．4 MTT實驗 將1×104個細胞重懸在200 μL培養基中種到96孔板中．處理后，培養基換成200 μL含0．5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h．棄掉上清，細胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min．測量490 nm處的OD值（SpectraMax公司，美國）．

1．5 統計學處理 采用SPSS17．0統計學軟件通過單邊非配對t檢驗對獨立樣本進行分析．所有統計結果的定量分析均采用標準誤（±SEM），并在圖中標注，P＜0．05表示差異具有統計學意義．

2 結果

2．1 MiR?31在膠質瘤組織中低表達 研究miR?31在膠質瘤中的功能，首先要檢測miR?31在膠質瘤中的表達水平，本研究收集了40例膠質瘤標本和各腫瘤組織對應的正常組織或癌旁組織．qRT?PCR檢測肝癌組織中miR?31的表達發現，miR?31在膠質瘤組織中的表達明顯低于在正常組織和癌旁組織中的表達（圖1）．

圖1 MiR?31在膠質瘤組織中的表達

2．2 MiR?31表達水平與膠質瘤惡性的關系 為了分析miR?31與膠質瘤惡性之間的關系，本研究進一步對不同級別膠質瘤組織中miR?31的表達進行了檢測．結果顯示，與一級膠質瘤組織相比，miR?31在二級和三級膠質瘤組織中的表達量顯著降低（圖2）．

圖2 MiR?31表達隨膠質瘤級別升高而降低

2．3 MiR?31在膠質瘤細胞中低表達 前期結果表明，miR?31在膠質瘤組織中低表達．為了進一步明確miR?31在膠質瘤中的表達情況，本研究檢測了幾種膠質瘤細胞中miR?31的表達水平（圖3）．結果顯示，與HEB細胞相比，miR?31在膠質瘤細胞系 U87、U251、T98和A172中的表達水平均顯著降低．說明miR?31在膠質瘤組織和細胞中都是低表達的．

圖3 MiR?31在膠質瘤細胞中的表達水平

2．4 MiR?31對膠質瘤細胞增殖的影響 根據前期結果，miR?31在膠質瘤組織和細胞中低表達，因此推測miR?31在膠質瘤中應該起抑癌基因的作用．因此本研究在U87和U251檢測了miR?31對膠質瘤細胞增殖的影響（圖4、5）．結果發現，miR?31對U87和U251增殖起明顯的抑制作用，而在miR?31過表達的同時加入antisense miR?31抵消miR?31的作用后，細胞的增殖得到明顯恢復，這些結果充分說明miR?31能夠抑制膠質瘤細胞的增殖．

圖4 MiR?31對U87細胞增殖的影響

圖5 MiR?31對U251細胞增殖的影響

3 討論

神經膠質瘤是大腦最常見的原發性惡性腫瘤．盡管治療技術不斷進步，包括手術、放射治療、光動力治療、化療等，但是惡性神經膠質瘤的預后依舊很差，其高發病率和高死亡率促使人們不斷尋找新的治療策略．MicroRNA是一種內源性非編碼RNA，MicroRNA可以通過靶向目標基因的3'UTR區在轉錄后水平抑制基因的表達［7］．多種人體癌癥被證明與miRNA的突變或錯誤表達有關．如卵巢癌［8］、肺癌［9－10］、肝癌［11］，結腸癌［12－13］和 GBM［14］等．MicroRNA的下調已經成為一個新的惡性腫瘤的特征，所以一些特定的microRNA可以成為腫瘤診斷和預后的生物標志物［15－19］．

MiR?31定位于染色體 9q21．3，該位置存在CDKN2等很多腫瘤抑制基因［20］．報道［21］稱 miR?31在肺癌中可通過與LATS、PPP2R2A抑癌基因相互作用影響細胞增殖，在頭頸腫瘤中也有類似發現．而在腸癌中，miR?31通過激活RAS信號通路抑制RASA1轉運，進而導致腫瘤生長和惡性．與此同時，在某些腫瘤中，miR?31又可發揮抑癌作用，如miR?31可以抑制乳腺癌增殖和惡性轉移．值得注意的是，miR?31在膠質瘤中的功能尚未見報道．本研究根據上述前期研究結果分析了miR?31在膠質瘤組織和細胞中的表達及對膠質瘤細胞增殖的影響．結果發現，miR?31在膠質瘤組織和細胞中都是低表達的，且表達水平隨著膠質瘤級別的升高而降低．在U87和 U251中，miR?31均抑制細胞生長，而同時加入 antisense RNA抑制miR?31作用后細胞增殖即恢復．這些結果說明miR?31在膠質瘤內屬于抑癌因子．

綜上所述，本研究發現miR?31在膠質瘤中低表達，并且能夠抑制膠質瘤細胞的增殖．miR?31在膠質瘤中的表達和作用的研究將有助于揭示膠質瘤發生發展的機制，使miR?31成為膠質瘤發生發展生理過程的指標，為未來膠質瘤的治療提供新靶點．

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Study on the expression and function of microRNA?31 in glioma

HOU Wen?Zhong，MAO Zhen?Min，ZENG Min?Min，GUAN Bei?Xuan，LIAO Guo?Min，CHEN Xiang?Lin Department of Neurosurgery，The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan City People's Hospital，Qingyuan 511516，China

AIM：To study the role of microRNA?31 in glioma．METHODS：The expression of miR?31 from different glioma tissues and glioma cells were detected by realtime?PCR，and the relationship between expression of miR?31 and the level of the gli?oma was analyzed．The effect on miR?31 for proliferation of glioma cells was detected by MTT．RESULTS：The expression of miR?31 in glioma tissues and cell lines were lower than normal tissues and cell lines．The higher the lever of glioma，the lower the expression of miR?31．In U87 and U251，miR?31 could inhibit the cell proliferation，while cell proliferation was recovered by inhibi?ting the expression ofmiR?31 added the antisense RNA．CONCLUSION：MiR?31 can inhibit the proliferation of glioma cells，and miR?31 may be a new target in the treatment of glioma in the future．

MicroRNA?31；glioma；malignant；preliferation；therapy target

2095?6894（2017）06?26?03

R739．41

A

2017－05－13；接受日期：2017－05－17

清遠市科技計劃項目（2016B025）

侯文仲．博士．E?mail：harzard＠sina．com