Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝

蔡 麗，陳忠敏，王富平，袁 森，阮廷飛

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

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Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝

蔡 麗，陳忠敏，王富平，袁 森，阮廷飛

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究料液比、提取溫度、提取時(shí)間、酶解時(shí)間及其交互作用對多糖得率的影響。結(jié)果表明：樺褐孔菌多糖的最優(yōu)提取工藝為：料液比1∶30，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間5 h，酶解時(shí)間65 min，多糖得率理論值為3.598%，實(shí)際測得多糖得率為(3.575±0.24)%。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可較好地對樺褐孔菌多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在該工藝下提取得到的樺褐孔菌多糖質(zhì)量穩(wěn)定。

樺褐孔菌；多糖；Box-Behnken響應(yīng)面分析法

樺褐孔菌，學(xué)名Fuscoporiaobliqua(Pers:Fr.) Aoshi或Inonotusobliquus(Fr.) Pilat，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、褐臥孔菌屬[1]，是一種含有多種活性物質(zhì)的藥用真菌，東歐及亞洲很多國家將其用于糖尿病、癌癥、免疫系統(tǒng)疾病的預(yù)防等[2-3]。自1977年Lobarzewski[4]首次從樺褐孔菌中分離出血紅素蛋白酶以來，各國學(xué)者相繼對樺褐孔菌的化學(xué)成分進(jìn)行了研究開發(fā)，Zheng等[5]對分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水萃取的樺褐孔菌產(chǎn)物類型進(jìn)行了分析，明確了不同溶劑中的提取物成分，Song等[6]發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌發(fā)揮抗癌效果的主要成分是多糖。

本研究以采自中國大興安嶺的樺褐孔菌為原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取溫度、提取時(shí)間、料液比、酶解時(shí)間對樺褐孔菌多糖得率的影響，旨在為樺褐孔菌多糖(IOPS)資源的合理利用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AE240 METTLER 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司)，真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料

樺褐孔菌采自大興安嶺，經(jīng)陳忠敏教授鑒定為樺褐孔菌Inonotus obliquus的子實(shí)體；纖維素酶、苯酚、濃硫酸、無水乙醇均購自成都市科龍化工試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 纖維素酶輔助提取樺褐孔菌多糖工藝

樺褐孔菌經(jīng)機(jī)械粉碎后，用20倍體積的濃度為85%的乙醇在70 ℃條件下回流兩次，每次3 h，過濾，去除上清，取濾渣于60 ℃真空干燥箱中干燥12 h揮干溶劑后即得預(yù)處理樺褐孔菌粉，分裝備用。取預(yù)處理的樺褐孔菌粉，加入pH值為5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液中,參考文獻(xiàn)[7]加入樺褐孔菌重量3%的纖維素酶于50 ℃條件下酶解一段時(shí)間后，迅速升溫至提取溫度進(jìn)行提取，過濾收集濾液，濃縮，加入濃縮液4倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，60 ℃真空干燥至恒重，即得樺褐孔菌粗多糖。

2.2 苯酚-硫酸法測樺褐孔菌多糖方法學(xué)的建立

1) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱定105 ℃真空干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，去離子水定容至100 mL，搖勻，得濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液。吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 mL，用去離子水定容至100 mL，得濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2) 供試品溶液的制備

精密稱取50 ℃干燥至衡重的樺褐孔菌粗多糖100 mg，用去離子水溶解并定容至100 mL，再精密量取20 mL用去離子水稀釋定容至100 mL作為供試品溶液。

3) 苯酚溶液的配制

精密量取苯酚溶液5 mL，置100 mL容量瓶中，加去離子水定容至刻度，搖勻即可。

4) 檢測波長的確定

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液 5 mL于10 mL容量瓶中，去離子水定容，取2 mL，立即加入5%苯酚溶液2 mL，濃硫酸10 mL，混勻，室溫放置30 min，待其冷卻后用紫外可見分光光度計(jì)在波長200～800 nm 范圍內(nèi)掃描，485 nm處有最大吸收峰，故選擇485 nm為檢測波長。

5) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL，去離子水定容至10 mL，得系列濃度為25、30、35、40、45、50、55、 60 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取2 mL，立即加入5%苯酚溶液2 mL，濃硫酸10 mL，混勻，室溫放置30 min，待其冷卻后用紫外可見分光光度計(jì)在485 nm處測吸光度，得葡萄糖濃度—吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-0.074 51+0.007 75x，R2=0.999，表明對照品濃度在25.00～60.00 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

6) 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取25 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，去離子水稀釋定容至50 mL，按“2.2.5”方法操作，分別連續(xù)測定6次吸光度，結(jié)果RSD為0.57%，表明本方法選用實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

7) 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法操作，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h測定吸光度，結(jié)果RSD為1.81%，表明樺褐孔菌粗多糖顯色后在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

8) 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱定6份標(biāo)準(zhǔn)品溶液、50 ℃真空干燥至衡重的樺褐孔菌多糖5 mg，按供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測定樣品溶液的吸光度，結(jié)果RSD為1.13%，表明本方法的重復(fù)性良好。

9) 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密量取適量供試品溶液6份，根據(jù)供試品溶液減半后總多糖的含量，加入含有等量無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：樺褐孔菌多糖的平均回收率為98.85%，RSD=1.36%(n=6)，均符合要求。

10) 多糖得率的計(jì)算

樺褐孔菌水提取物得率(%)=提取物干重(g)/樺褐孔菌粉質(zhì)量(g)×100%

樺褐孔菌多糖純度(%)=測得的多糖的質(zhì)量(g)/樺褐孔菌提取物的量(g)×100%

樺褐孔菌多糖得率(%)=樺褐孔菌水提取物得率(%)×樺褐孔菌多糖純度(%)

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取已預(yù)處理的樺褐孔菌粉，每份6.00 g，分別考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間、酶解時(shí)間、提取次數(shù)5個(gè)單因素對樺褐孔菌多糖得率的影響。

表1 樺褐孔菌多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對樺褐孔菌多糖提取率的影響

精密稱定6.00 g已預(yù)處理的樺褐孔菌粉，以料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60分別加入pH值5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,再加入樺褐孔菌重量3%的纖維素酶,50 ℃酶解60 min，迅速升溫至95 ℃，提取5 h，考察多糖得率。結(jié)果顯示：在料液比為1∶10～1∶30之間時(shí)，隨著提取液量的增加，多糖得率逐漸增大；在料液比為1∶30～1∶50時(shí)，隨著提取液量的增大，多糖得率逐漸降低(圖1)。這是因?yàn)樵弦欢〞r(shí)，提取液用量過大會導(dǎo)致提取物種類更豐富，從而影響多糖的溶出和醇沉濃度。因此，本實(shí)驗(yàn)選取1∶30為最佳料液比。

2.3.2 提取溫度對樺褐孔菌多糖提取率的影響

精密稱定6.00 g已預(yù)處理的樺褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH=5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,再加入樺褐孔菌重量3%的纖維素酶,50 ℃酶解60 min，分別在提取溫度65、75、85、95、100 ℃條件下提取5 h，考察多糖得率。結(jié)果如圖2，隨著提取溫度的升高，多糖得率逐漸變大，達(dá)峰值后繼續(xù)升溫會使多糖得率略有下降，可能是因?yàn)闇囟冗^高會導(dǎo)致部分熱不穩(wěn)定性多糖分解，因此選擇(90～95) ℃為最佳提取溫度。

2.3.3 提取時(shí)間對樺褐孔菌多糖提取率的影響

精密稱定6.00 g已預(yù)處理的樺褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH值5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,再加入樺褐孔菌重量3%的纖維素酶,在50 ℃下酶解60 min，提取溫度為95 ℃時(shí)，考察分別提取2，3，4，5，6 h時(shí)的多糖得率。結(jié)果如圖3，多糖得率在提取時(shí)間2～5 h內(nèi)隨時(shí)間的增加顯著升高，此后增加提取時(shí)間多糖得率略有下降，這可能與提取時(shí)間過長會增加提取液黏度、不利于多糖的溶出有關(guān)。考慮到成本與產(chǎn)率因素，提取時(shí)間選擇5 h為宜。

2.3.4 酶解時(shí)間對樺褐孔菌多糖提取率的影響

精密稱定6.00 g已預(yù)處理的樺褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH值5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,再加入樺褐孔菌重量3%的纖維素酶,分別在50 ℃下酶解30、45、60、75、90 min，迅速升溫至95 ℃，提取5 h，分析酶解時(shí)間對多糖得率的影響。圖4結(jié)果表明：隨著酶解時(shí)間的延長，多糖得率呈先顯著升高再緩慢下降的趨勢，說明酶解時(shí)間過長可能會使部分多糖碳環(huán)裂解，從而降低多糖得率。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇60 min為最佳酶解時(shí)間。

2.3.5 提取次數(shù)對樺褐孔菌多糖提取率的影響

精密稱定6.00 g已預(yù)處理的樺褐孔菌粉，以料液比1∶30加入pH值5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,再加入樺褐孔菌重量3%的纖維素酶,分別在50 ℃下酶解60 min，迅速升溫至95 ℃，提取5 h，分別提取1、2、3、4、5次，考察提取次數(shù)對多糖得率的影響。結(jié)果如圖5所示，多次提取并不會顯著提高多糖得率，考慮到提取工藝的簡便性和經(jīng)濟(jì)性，本實(shí)驗(yàn)提取次數(shù)確定為1次。

圖1 料液比對多糖得率的影響

圖2 提取時(shí)間對多糖得率的影響

圖3 提取溫度對多糖得率的影響

圖4 酶解時(shí)間對多糖得率的影響

圖5 提取次數(shù)對多糖得率的影響

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)1次的情況下優(yōu)選出4個(gè)主要影響因素：料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、酶解時(shí)間(D)，設(shè)計(jì)4因素3水平(共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn))響應(yīng)面試驗(yàn)方案。因素及水平見表2，試驗(yàn)安排與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平

2.4.2 模型擬合

利用Design-Expert 7.1.6軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，得樺褐孔菌多糖得率(Y)與4個(gè)試驗(yàn)因素之間的模擬方程：

Y=3.54-0.013A+0.14B+0.19C+ 0.15D-0.15AB+0.017AC+0.14AD+ 0.065BC-0.018BD+0.12CD- 0.25A2-0.41B2-0.47C2-0.29D2

對該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。該回歸模型F值小于0.01，模型決定系數(shù)R2=0.979 6，C.V.=2.43，說明回歸方程擬合相對顯著。失擬項(xiàng)F值1.06，失擬項(xiàng)P=0.5206>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明模型擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，實(shí)驗(yàn)操作性可信。提取溫度、提取時(shí)間、酶解時(shí)間對多糖得率的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，料液比對多糖得率的影響不顯著。影響樺褐孔菌多糖得率的各因素按主次排序?yàn)椋禾崛囟?酶解時(shí)間>提取時(shí)間>料液比。

2.4.3 響應(yīng)面分析

由方差分析結(jié)果可知：料液比/提取溫度、料液比/酶解時(shí)間和提取時(shí)間/酶解時(shí)間的交互作用對多糖得率有顯著影響。繪制可直觀反映各因素交互作用對樺褐孔菌多糖得率影響的響應(yīng)面分析圖，見圖6。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用該模型預(yù)測樺褐孔菌多糖提取的最佳工藝條件為：料液比1∶30.05，提取溫度91.83 ℃，提取時(shí)間4.94 h，酶解時(shí)間64.51 min，此條件下多糖得率理論值為3.598%。綜合考慮實(shí)驗(yàn)操作以及各方面客觀因素，修正樺褐孔菌多糖最佳提取工藝為：料液比1∶30，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間5 h，酶解時(shí)間65 min。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得多糖得率為(3.575±0.24)%，與理論值接近，驗(yàn)證了上述響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝的準(zhǔn)確性。

表4 樺褐孔菌多糖回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

注：*P<0.05，差異顯著；**P<0.001，差異極顯著

圖6 各兩兩因素交互作用對樺褐孔菌多糖得率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)束語

纖維素酶在多糖提取中可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)而使有效成分最大程度地溶出，因提取條件溫和、能耗低、易控制的特點(diǎn)而受到科研工作者的青睞[8]。優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝時(shí)，需尋找最佳因素水平組合，但目前常用的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的明確函數(shù)表達(dá)式即回歸方程，且不能全面地研究各因素之間的交互作用，而均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)則以犧牲部分正交性、最大化地追求均勻性來達(dá)到減少試驗(yàn)次數(shù)為目的，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)沒有考慮全部交互作用，只有通過回歸分析時(shí)引入因素之間的交叉乘積項(xiàng)等來進(jìn)行探索，導(dǎo)致其結(jié)果的不穩(wěn)定。

相比之下，響應(yīng)面分析法可連續(xù)對影響因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析，并在影響因素與響應(yīng)值之間確立數(shù)學(xué)模型，具有預(yù)測性好、精度高、直觀、簡單的優(yōu)點(diǎn)，因而表現(xiàn)出突出的優(yōu)勢[9]。本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶預(yù)處理結(jié)合常規(guī)水提醇沉法提取樺褐孔菌多糖，鑒于Box-Behnken設(shè)計(jì)所需的試驗(yàn)次數(shù)相對較少、效率更高且所有的影響因素不會同時(shí)處于高水平，所有的試驗(yàn)點(diǎn)都落在安全操作區(qū)域內(nèi)等優(yōu)點(diǎn)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法優(yōu)化樺褐孔菌多糖的提取工藝。

數(shù)據(jù)結(jié)果表明：料液比、提取溫度、提取時(shí)間和酶解時(shí)間對樺褐孔菌多糖提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系，最終得到了與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合程度較高的數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型合理可靠。同時(shí)，優(yōu)化出了樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝參數(shù)：料液比1∶30，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間5 h，酶解時(shí)間65 min，在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得樺褐孔菌多糖得率(3.575±0.24)%，與理論值十分接近。該方法重復(fù)性好且簡單環(huán)保，在一般實(shí)驗(yàn)室條件下都能實(shí)現(xiàn)，可廣泛應(yīng)用于樺褐孔菌多糖的提取。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Optimization of Extraction Process for Polysaccharide from Inonotus Obliquus by Box-Behnken Response Surface Methodology

CAI Li，CHEN Zhong-min，WANG Fu-ping，YUAN Sen，RUAN Ting-fei

(College of Pharmacy and Biological Engineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China)

This study aimed to obtain the optimum extraction process of polysaccharide from Inonotus Obliquus. The response surface methodology(RSM) was used to optimize the extraction process.Liquid/solid ratio，extraction temperature，extraction time，enzymatic hydrolysis time were selected as independent variables on the basis of single factor experiments. The yield of polysaccharides was chosen as the response variable. An extraction condition with solid-liquid ratio 1∶30, extraction temperature 90 ℃, extraction time 5 h and enzymatic hydrolysis 65 min is optimal. The extraction yield under the optimized conditions is(3.575±0.24)%, agreeing with the predicted value. The results indicated that this method can rationally optimize extraction process of polysaccharide from Inonotus Obliquus.

inonotus; polysaccharides; Box-Behnken response surface methodology

2017-03-18

蔡麗(1991—)，女, 碩士研究生，主要從事藥物合成提取及天然藥物研究，E-mail：851702462@qq.com；通迅作者 陳忠敏，女，教授，主要從事藥物合成提取及天然藥物研究，E-mail：chenzhongmin@cqut.edu.cn。

蔡麗，陳忠敏，王富平，等.Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2017(6):113-119.

format：CAI Li，CHEN Zhong-min，WANG Fu-ping，et al.Optimization of Extraction Process for Polysaccharide from Inonotus Obliquus by Box-Behnken Response Surface Methodology[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(6):113-119.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.06.017

R284.2

A

1674-8425(2017)06-0113-07