三角豆蛋白的提取及Osboren分類

孫雁霞， 李牧澤， 李 杰， 羅 倩， 時羽杰， 王躍華， 鄔曉勇

(成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

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三角豆蛋白的提取及Osboren分類

孫雁霞， 李牧澤， 李 杰， 羅 倩， 時羽杰， 王躍華， 鄔曉勇

(成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

以成熟干燥的三角豆為原料，采用酸沉堿提的方法進行蛋白質提取，再將提取后的蛋白分成透析蛋白和未透析蛋白兩組，進行Osboren分類法分級提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，并測定分類蛋白的含量.按照Osboren分類法分級提取未透析的三角豆蛋白所得的清蛋白含量229.9 mg，球蛋白含量343.3 mg，醇溶蛋白含量66.6 mg，谷蛋白含量341.8 mg，所占比例依次為23.4%、35%、6.8%、34.8%，透析后的三角豆蛋白提取到的清蛋白含量144.2 mg，球蛋白含量341.8 mg，醇溶蛋白含量70.7 mg，谷蛋白含量328.9 mg,所占比例依次為16.3%、38.6%、8%、37.1%.

三角豆；蛋白質含量；蛋白提取；Osboren分類法

0 引 言

三角豆又名鷹嘴豆，其種植歷史久遠，主要分布在溫暖而干燥的地區，全球各地均有種植[1-2].三角豆具有適應性強，耐旱、耐寒與耐貧瘠等特點，對病蟲害的抵抗能力較強[3].由于三角豆所具有的較強耐寒性，且在植物分類上近似豆科作物苜蓿，故逐漸成為研究干旱脅迫模式的作物之一[4].研究表明，三角豆含有豐富的蛋白質、食用纖維、礦物質和不飽和脂肪酸等營養物質，還含有異黃酮和皂苷等多種生理活性物質[5-6].科研人員按蛋白質的溶解性將三角豆劃分為4種類型，即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，并根據蛋白質組分在不同溶劑中的溶解性，采用蒸餾水、稀鹽、乙醇、稀堿來提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白[7].本研究以成熟干燥的三角豆為材料，通過酸沉堿提方法對三角豆蛋白進行提取，然后進行Osboren蛋白質分類以及含量的測定，為進一步研究三角豆蛋白的理化性質等提供相關的實驗數據.

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用材料為成熟干燥的三角豆.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；分光光度計(上海光學儀器公司)；pH計(上海雷磁公司)；超純水儀(西安優普儀器設備有限公司)；磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；電子天平(上海速展機電公司)；電動粉碎機(鄭州中谷機械設備有限公司)等.

1.3 試 劑

實驗所用試劑包括：石油醚、NaOH、HCl、NaCl、無水乙醇、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白等，購自成都科龍化工有限公司，均為分析純.

1.4 方 法

1.4.1 三角豆的預處理.

將三角豆用粉碎機制成粉末，取一定量的粉末加入石油醚進行兩次除油，每次時間1 h.將除油后的粉末置于通風櫥中揮發溶劑，得到的干燥粉末包裝備用.

1.4.2 三角豆蛋白的提取方法.

稱取350g的三角豆粉末，將三角豆粉末與蒸餾水混合，用1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至9.6，水浴50 ℃攪拌浸提1 h，離心，收集上清液.用1 mol/L的HCl溶液將上清液的pH值調至4.0，此時，蛋白從上清液中沉淀.渾濁液用離心機在6 000 r/min下離心20 min，收集沉淀物.

1.4.3 冷凍干燥.

將所得到的沉淀物平鋪于大培養皿上，分別用蒸餾水將其溶解，然后將其置于-20℃冷凍成冰備用.

1.4.4 透析除鹽.

將冷凍成冰的蛋白解凍， 并對透析袋進行使用前處理后，將解凍后的蛋白溶液用超純水進行透析，每4 h換一次水，持續24 h.將溶液分成透析液與未透析液2類，然后進行冷凍保存.

1.4.5 Osboren分級提取[7].

將透析與未透析的蛋白溶液各取一定體積，然后各自進行分級提取.實驗流程如下：定量后的蛋白溶液加入10倍體積的水于40 ℃恒溫攪拌2 h；10 000 r/min離心30 min，沉淀得上清液A；加入10倍體積的2.0% NaCl溶液于40 ℃恒溫攪拌2 h，4 000 r/min離心30 min，沉淀得上清液B；加入10倍體積的75%乙醇溶液于40 ℃恒溫攪拌2 h，4 000 r/min離心30 min，沉淀得上清液C；加入10倍體積0.01 mol/L的NaOH溶液于40 ℃恒溫攪拌30 min，4 000 r/min離心30 min，得上清液D.

由于上清液A、B、C、D中分別含有三角豆清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和三角豆谷蛋白，故本實驗采用考馬斯亮藍法分別測定上清液A、B、C、D中蛋白質的含量.

1.4.6 標準牛血清蛋白定制標準曲線.

配制100 μg /mL 的牛血清蛋白原液，并將此牛血清蛋白原液稀釋10倍以后，在6支試管中，分別精確吸取稀釋后的牛血清蛋白原液0.00 mL(空白對照)、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，用蒸餾水全部稀釋至1.0 mL，然后分別加入5.00 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻，于25 ℃的恒溫水浴中保溫10 min，經冷水浴中冷卻后，立即于分光光度計595 nm波長處比色測定.以試管中標準蛋白的總含量為橫坐標，相應的吸光度值(A)為縱坐標作標準曲線圖，并作線性回歸，求線性方程.

1.4.7 Osboren分級蛋白吸光度的測定.

分別取水提蛋白、堿提蛋白、鹽提蛋白分級提取所得到的A、B、C、D 4種蛋白質1.00 mL，加入5.00 mL考馬斯亮藍G-250溶液，混合均勻，于25 ℃的恒溫水浴中保溫10 min，經冷水浴中冷卻后，立即于分光光度計595 nm波長處進行比色測定.

2 結果與分析

2.1 標準曲線及回歸方程

按“1.4.6”項下方法，通過分光光度計在波長595 nm處測得梯度濃度蛋白溶液的吸光度值如表1.

表1 595 nm波長下蛋白標準溶液的吸光度值

根據表1數據制得標準曲線如圖1所示.

圖1 牛血清蛋白標準曲線

根據牛血清蛋白標準曲線可以得到回歸方程，

y=0.6954x+0.0133

其中，y為吸光度，x為蛋白質濃度，線性相關系數R2=0.9992.

2.2 三角豆總蛋白含量與Osboren分級處理蛋白的含量及其比較

2.2.1 三角豆總蛋白及Osboren分級處理蛋白的吸光度值.

將冷凍后的蛋白溶液定體積分成透析與未透析蛋白先進行稀釋，再進行總蛋白測定，得到蛋白OD值.結果顯示，透析后的OD值為0.223，未透析的OD值為0.237.透析和未透析蛋白進行Osboren分級后4種蛋白的OD值如表2所示.

表2 595 nm波長下蛋白溶液的吸光度值

2.2.2 Osboren分級處理蛋白的含量比較.

根據考馬斯亮藍定制的標準曲線(y=0.6954x+0.0133)，將各蛋白測得的吸光度值分別代入線性回歸方程求得對應蛋白的含量如表3所示.

表3 Osboren分級處理蛋白的含量(mg)

A、B、C、D分別表示的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白.從表2和表3可以看出，表2的OD值相近，但是表3含量卻相差比較大，這是由于在同體積三角豆液按照Osboren分級依次提取后，為了提高準確性，在測量OD值前，將A稀釋了2倍，B和D稀釋了5倍，只有C沒有改變.

2.3 三角豆蛋白的組成

Osboren 分級提取法是研究蛋白質常用的分類方法之一，這種方法是根據蛋白質在水、鹽、醇以及堿溶液中的溶解性來劃分的.但該法較粗略，只能是對結構類似的蛋白的一種大致估計.本實驗對堿法提取的三角豆蛋白按Osboren分級，根據表2、表3所得數據，通過計算得知，未透析的三角豆總蛋白中清蛋白所占比例為23.4%、球蛋白為35%、醇溶蛋白為6.8%、谷蛋白為34.8%.透析過的三角豆清蛋白所占比例為16.3%、球蛋白為38.6%、醇溶蛋白為8%、谷蛋白為37.1%.不難看出，二者除了清蛋白含量有些不同之外，其他的3種蛋白不論從比例上和含量上都相差無幾，并且4種蛋白含量上來看，醇溶蛋白是最少的.

3 結 論

本實驗采用酸沉堿提的方法對三角豆進行蛋白質提取.按照Osboren分類法進行提取后，分別得到了三角豆清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白.由表3可以看出，未透析的清蛋白229.9 mg、球蛋白343.3 mg、醇溶蛋白66.6 mg、谷蛋白為341.8 mg，而透析過的清蛋白含量為144.2 mg、球蛋白341.8 mg、醇溶蛋白70.7 mg、谷蛋白為328.9 mg.2組數據除了清蛋白差別大以外，其他種類含量相近，這很有可能是由于對三角豆進行總蛋白提取的時候使用的堿法提取，這樣使三角豆蛋白溶液中含有鈉離子和氯離子，在未透析的這一組當中，所提取后的清蛋白很有可能是含有很多球蛋白，對后面的球蛋白有些影響，而經過透析的三角豆蛋白液所提取的清蛋白中所含的其他蛋白雜質更少.該法較粗略，只能是對結構類似的蛋白的一種大致估計，而且分離的蛋白質容易混雜不純.

三角豆蛋白作為一種新型的植物蛋白資源，是一種高蛋白豆類來源，其開發與利用對緩解我國蛋白資源短缺有重要意義.利用酸沉堿提的方法可以對三角豆蛋白進行提取，且提取率較高.

[1]何妍紅.鷹嘴豆營養價值及其應用[J].中國科技博覽,2015，22(14):355-355.

[2]包興國,楊蕊菊,舒秋萍.鷹嘴豆的綜合開發與利用[J].草業科學,2006,23(10):34-37.

[3]Bhattarai T,Fetting S.Isolationandcharaacterizationofadehydringenefromcicerpinnatifidum,adroughtresistantwildrelativeofckpea[J].Physiol Plantar,2005,123(4):452-458.

[4]Shukla R K,Raha S,Tripathi V,et al.ExpressionofCAP2,anAPETALA2familytranscriptionfactorfromchickpea,enhancesgrowthandtolerancetodehydrationandsaltressintransgenoctobacco[J].Plant Physiol,2006,142(1):113-123.

[5]馬螈,周磊,包磊.鷹嘴豆的成分分析[J].四川食品與發酵,2008,44(6):57-58.

[6]肖輝,張月明,于亞鷺.鷹嘴豆精粉對高脂大鼠的血脂代謝的影響[J].中國公共衛生,2005,21(7):843-845.

[7]Peng H,Cheng H Y,Yu X W,et al.Molecularanalysisofanactingenne,CarACT1,fromchickpea(CicerarietinumL)[J].Mol Biol Rep,2010,37(2):1081-1084.

Extraction of Triangle Beans Protein and Classification of Osboren

SUNYanxia,LIMuze,LIJie,LUOQian,SHIYujie,WANGYuehua,WUXiaoyong

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The mature and dried triangle beans were used as the raw material and the total protein from triangle beans was extracted by alkali extraction and acid precipitation method.Then the protein was classified into dialysis and non-dialysis protein groups.Each group was treated by Osboren taxonomy classification to extract albumin,globulin,gliadin and gluten protein and the contents of each protein were determined.According to Osboren classification,as for the contents of the proteins from non-dialysis,when albumin was 229.9 mg,globulin,343.3 mg,gliadin,66.6 mg and gluten，341.8 mg,the proportion was 23.4%,35%,6.8% and 34.8% respectively;meanwhile for the contents of the proteins from dialysis group,when albumin was 144.2 mg,globulin，341.8 mg,gliadin，70.7 mg and gluten，328.9 mg,the proportion was 16.3%,38.6%,8% and 37.1%,respectively.

triangle beans;protein content;protein extraction;Osboren classification

1004-5422(2017)02-0135-03

2017-01-24.

孫雁霞(1976 — )， 女， 博士， 副教授， 從事植物生物相關技術研究.

TS201.2+1；S529

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