Raf—1、MEK—2、ERK—1在胃癌組織中的表達及其意義

姜浩+孫治國

[摘要] 目的 探討Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中的表達形式及其意義，并分析此種信號途徑與胃癌的臨床病理特征之間是否存在聯系，并為胃癌抗EGFR靶向治療的分子標志物篩選提供依據。 方法 通過免疫組化中SP法檢測60例胃癌患者標本胃癌組織和正常的胃組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達水平并進行比對。 結果 經統計60例胃癌組織當中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達率分別為88.33%（53/60）、85.00%（51/60）、78.33%（47/60）。而正常的胃組織當中Raf-1、MEK-2、ERK-1均未見到陽性表達。被胃癌細胞轉移的淋巴結組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的陽性表達率更為顯著，分別高達95.12 %（39/41），90.24 %（37/41），87.80 %（36/41）。未見癌細胞轉移的淋巴結中Raf-1、MEK-2、ERK-1均無表達。實驗證實Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達水平與胃癌的臨床特征中的腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期有明顯相關性（P<0.05）。 結論 （1）人體胃癌組織當中存在Raf/MEK/ERK信號通路的激活；（2）人體胃癌組織中Raf/MEK/ERK信號通路的活化程度與胃癌組織的臨床病理特征相關，此信號通路活化程度越高的胃癌組織，其分化的程度越低，TNM分期越高。三者聯合檢測可為研究胃癌的生物學行為乃至對靶向治療胃癌提供十分重要的參考依據及指標。

[關鍵詞] 胃癌；Raf-1；MEK-2；ERK-1；Raf/MEK/ERK；免疫組化

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）15-0030-04

[Abstract] Objective To investigate the expression pattern and significance of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in gastric carcinoma and analyze whether there is a link between this signaling pathway and the clinicopathological features of gastric cancer，and to provide the basis for the screening of molecular markers for gastric cancer anti-EGFR targeted therapy. Methods The expression levels of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in gastric cancer tissues and normal gastric tissueswere detected by SP immunohistochemical method and compared in 60 patientswith gastric cancer. Results The expression rates of Raf-1， MEK-2 and ERK-1were 68.33% （53/60）， 85.00% （51/60） and 78.33% （47/60） respectively in 60 cases of gastric cancer. However， the positive expressions of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were not observed in normal gastric tissues. The positive expression rates of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in lymph node metastasis of gastric cancer cells were 95.12%（39/41）， 90.24%（37/41）， 87.80%（36/41）， which were significantly higher. Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were not expressed in lymph nodes without lymph node metastasis. The expression levels of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were significantly correlated with the degree of tumor differentiation， depth of invasion，lymph node metastasis and TNM staging in the clinical features of gastric cancer（P<0.05）. Conclusion （1） The activation of Raf/MEK/ERK signaling pathway is existed in human gastric cancer tissues； （2）The activation degree of Raf/MEK/ERK signaling pathway in human gastriccancer tissue is related to clinicopathological features of gastric cancer tissue. The higher the degree of activation of this signal pathway in gastric cancer tissues， the lower the degree of differentiation， and the higher the TNM staging. The combined detection of the three can provide a very important reference and indicator for the study of the biological behavior and the targeted treatment of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer； Raf-1； MEK-2； ERK-1； Raf/MEK/ERK； Immunohistochemistry

胃癌是最常見的惡性腫瘤，目前死亡率很高，居世界第三位[1]。全世界范圍內胃癌預后欠佳，其原因是發現病灶較晚，以致晚期胃癌比例較大。而且晚期胃癌對所有傳統治療效果均欠佳，包括化學治療、手術切除、以及放化療聯合等[2]。近些年，以肺癌、乳腺癌、結直腸癌為代表的實體腫瘤，已經進入分子靶向治療的新時代。目前，探索和研究胃癌的分子靶向治療有很大發展前景。其中EGFR（表皮生長因子受體）是目前研究的主要靶點之一，它與腫瘤的轉移和血管形成有關[3]，但直至目前，世界范圍內還沒有公認的預測胃癌抗EGFR靶向治療的分子標志物[4]，Raf/MEK/ERK信號通路是目前已經明確的EGFR調節通路中十分重要的一個，在胃癌組織的代謝、增殖、生長、分化、凋亡過程中起到重要的作用。國內外對Raf/MEK/ERK信號通路的研究和報道很少，本文通過研究Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中的表達情況，以此判斷胃癌的生物學特性，為尋找胃癌中抗EGFR靶向治療的腫瘤分子標記物進行初步探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取我院2012年1月～2014年12月行胃癌手術的患者60例，男45例，女15例，年齡31～78歲，中位年齡55歲。所有患者均為首次手術，且手術前均未接受放、化療及免疫治療，臨床和病理資料均完整。

1.2 試劑

第一抗體為濃縮型兔抗人多克隆抗體Raf-1、MEK-2、ERK-1，工作濃度1∶400（美國GeneTex生物技術公司）。第二抗體為即用型生物素標記的羊抗兔IgG（福州邁新生物技術有限公司）。

1.3 方法

60例胃癌標本分為癌組織、正常胃組織、轉移淋巴結、未轉移淋巴結共四組，其中正常胃組織60例、胃癌組織60例、癌細胞轉移淋巴結41例、未見癌細胞轉移淋巴結19例。每組實驗標本均經10%的中性福爾馬林浸泡固定，后以石蠟包埋，分別制成4 μm厚切片5張，其中一張標本行常規HE染色，供組織學觀察并且行病理診斷和分型，另外一張采用PBS法取代第一抗體行免疫組化染色作為陰性對照片，陽性對照采用已知陽性片為標準，剩余3張按抗體試劑說明書染色，步驟采用SP法進行免疫組化染色。

1.4 結果判斷[5]

由兩位資深病理科醫師分別觀察每張標本切片后進行綜合分析判斷。光學顯微鏡下觀察，首先根據細胞的染色程度進行計分，細胞無顯色計0分；淺黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。再在高倍顯微鏡下隨機選取10個視野，記錄其中陽性細胞數占細胞總數的百分比，取其平均值，根據陽性細胞所占細胞總數的比值記分：0：0分；≤25%：1分；26%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%：4分。標本細胞的染色程度記分與陽性細胞比例計分的和為每例標本的最終積分。0分陰性（-），2～3分弱陽性（+），4～5分中度陽性（++），6～7分強陽性（+++）。

1.5 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件包進行分析，對數據采用精確概率檢驗、χ2檢驗與Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及正常的胃組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達

Raf-1、MEK-2、ERK-1染色主要都位于細胞漿中，呈現出淺黃色、棕黃色及棕褐色的著色，以團簇狀或散在進行分布，（見封三圖4分別為A、B、C），60例胃癌組織標本中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達均呈陽性，表達率分別為88.33%（53/60）、85.00%（51/60）、78.33%（47/60），而正常的胃組織中三種蛋白均無表達。

2.2 淋巴結中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達

Raf-1、MEK-2、ERK-1染色位同樣位于轉移淋巴結癌細胞的細胞漿中，呈現出淡黃色至棕黃色及棕褐色的著色，以團簇狀或散在進行分布，（見封三圖4分別為D、E、F），癌細胞轉移的淋巴結組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的陽性表達率分別為95.12%（39/41），90.24%（37/41），87.80%（36/41），無癌細胞轉移的淋巴結組織中均未表達。

2.3 Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系

見表1。

2.4 Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中及轉移淋巴結中的表達

60例胃癌患者中，男45例，Raf-1陽性表達40例，陰性表達5例，Mek-2陽性表達38例，陰性表達7例，Eek-1陽性表達36例，陰性表達9例。女性15例，Raf-1陽性表達13例，陰性表達2例，Mek-2陽性表達13例，陰性表達2例，Eek-1陽性表達11例，陰性表達4例，差異無統計學意義（P>0.05）。年齡>55歲的37例，Raf-1陽性表達32例，陰性表達5例，Mek-2陽性表達32例，陰性表達5例，Eek-1陽性表達29例，陰性表達8例。年齡≤55歲的23例，Raf-1陽性表達21例，陰性表達2例，Mek-2陽性表達19例，陰性表達4例，Eek-1陽性表達18例，陰性表達5例，差異無統計學意義（P>0.05）。腫瘤位于胃底/賁門的16例，Raf-1陽性表達14例，陰性表達2例，Mek-2陽性表達13例，陰性表達3例，Eek-1陽性表達12例，陰性表達4例。腫瘤位于胃竇/胃體的44例，Raf-1陽性表達39例，陰性表達5例，Mek-2陽性表達38例，陰性表達6例，Eek-1陽性表達35例，陰性表達9例，差異無統計學意義（P>0.05）。60例癌組織中，Raf-1陽性表達53例，陰性表達7例，Mek-2陽性表達51例，陰性表達9例，Eek-1陽性表達47例，陰性表達13例，60例正常胃組織中，Raf-1、Mek-2、Eek-1均未表達，P<0.05差異有統計學意義。中分化34例，Raf-1陽性表達28例，陰性表達6例，Mek-2陽性表達26例，陰性表達8例，Eek-1陽性表達23例，陰性表達11例。低分化26例，Raf-1陽性表達24例，陰性表達2例，Mek-2陽性表達22例，陰性表達4例，Eek-1陽性表達21例，陰性表達5例，差異無統計學意義（P>0.05）。腫瘤浸潤深度T1/T2期27例，Raf-1陽性表達21例，陰性表達6例，Mek-2陽性表達20例，陰性表達7例，Eek-1陽性表達18例，陰性表達9例。腫瘤浸潤深度T3/T4期33例，Raf-1陽性表達32例，陰性表達1例，Mek-2陽性表達31例，陰性表達2例，Eek-1陽性表達29例，陰性表達4例，差異無統計學意義（P>0.05）。TNM分期I+II 21例，Raf-1陽性表達16例，陰性表達5例，Mek-2陽性表達14例，陰性表達7例，Eek-1陽性表達12例，陰性表達9例。TNM分期Ⅲ+Ⅳ39例，Raf-1陽性表達37例，陰性表達2例，Mek-2陽性表達35例，陰性表達4例，Eek-1陽性表達33例，陰性表達6例，差異無統計學意義（P>0.05）。有淋巴結轉移41例，Raf-1陽性表達39例，陰性表達2例，Mek-2陽性表達37例，陰性表達4例，Eek-1陽性表達34例，陰性表達7例。無淋巴結轉移19例，Raf-1、Mek-2、Eek-1均未表達，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

Raf/MEK/ERK是我們已經知道的EGFR最重要的調節傳導通路之一[6-10]。Raf/MEK/ERK通路可以通過磷酸化的活化方式將多種細胞外信號逐級傳遞至細胞核，激活多種轉錄因子，在細胞增殖、分化、生長抑制乃至細胞凋亡中都起著尤為重要的調控作用[11]。本實驗采用免疫組織化學SP法檢測60例胃癌患者標本中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達水平，實驗結果表明Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中的陽性表達顯著高于正常胃組織，并且三者之間的陽性表達趨勢完全一致，呈正相關性，充分證明了Raf/MEK/ERK信號通路在人體胃癌組織中被激活，并且提示它們在誘導人體胃癌細胞的基因轉錄與表達，及在促進胃癌細胞增殖及轉移過程中存在承擔信號傳導的協同作用，其具體聯系機制尚有待進一步研究。

在被胃癌細胞轉移的淋巴結組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1明顯升高，而未被胃癌細胞轉移的淋巴結組織中無表達。Tan等[12]對人和倉鼠的胰腺癌細胞株進行研究時發現，當誘導胰腺癌細胞島狀集落解離時，胰腺癌細胞中ERK蛋白的表達也明顯升高，所以推斷MEK/ERK信號通路可能起到誘發人或倉鼠胰腺癌細胞解離、促進胰腺癌細胞的侵襲和轉移。Viala等[13]則認為激活后的ERK信號通路能起到增強腫瘤細胞運動及促進腫瘤細胞轉移的作用。

我們進一步發現，Raf-1、MEK-2、ERK-1的陽性表達與人體胃癌細胞的分化程度、浸潤深度及TNM分期都顯著相關（P<0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤生長部位尚無相關性（P>0.05）。在侵及胃漿膜層的胃細胞癌中，Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達率要明顯高于未侵及胃漿膜層者（P<0.05），病理分型為低分化的人胃癌組織細胞中Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達率高于分型為中分化的人胃癌組織（P<0.05），臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的人胃癌組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達率均高于Ⅰ期和Ⅱ期（P<0.05），研究證明人胃癌組織細胞中Raf/MEK/ERK信號通路的活化程度與人體胃癌組織的臨床及病理特征存在關聯，Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達率越高的胃癌組織分化程度越低，其侵襲性越大，引起淋巴結轉移的傾向越高，TNM分期也越高，足以證明被激活的Raf/MEK/ERK信號通路參與人體胃癌組織的浸潤及淋巴結轉移。而隨著腫瘤的浸潤、轉移能力的增強和病情的進展，Raf-1、MEK-2、ERK-1表達也增強，這與Meng等[14]關于Raf-1在人體胃癌組織細胞中導致腫瘤分化、生長、浸潤、轉移的研究結果相一致。James等[15]研究發現ERK阻斷劑PD98059抑制ERK活化后，細胞周期G1/S期轉化明顯抑制，針對性的抑制Raf/MEK/ERK傳導通路的活化將有助于抑制腫瘤細胞的異常表達，達到及早控制腫瘤的目的，進一步輔助胃癌的早期治療。

同時我們還發現，Raf-1、MEK-2、ERK-1三者在胃癌組織中高表達的同時，其陽性表達率有逐步衰減趨勢，可能在EGFR/Raf/MEK/ERK傳導通路中有其他因素發揮抑制其表達的作用，Steelman等[16]研究證明抗白血病治療時，通過藥物抑制劑作用于Raf/MEK/ERK傳導通路中作用點之間通路，可以有效地控制這一途徑表達，提高白血病療效。我們下一步研究計劃準備尋找這些因素，并將其抑制作用擴大，有針對性地抑制Raf/MEK/ERK信號通路的傳導，阻止或延緩腫瘤的發生，針對胃癌抗EGFR的靶向治療研究正逐步興起，對Raf/MEK/ERK信號通路進行探索，這些因素極有可能為胃癌抗EGFR靶向治療的分子標志物篩選提供依據，也可能成為治療胃癌的新靶點。

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