改進雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的溶出度測定方法Δ

張 勉，李 超（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

·藥物分析與檢定·

改進雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的溶出度測定方法Δ

張 勉＊，李 超（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

目的：改進雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的溶出度測定方法。方法：采用槳法進行溶出試驗，以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質，溶出介質體積為500m L，轉速為75 r/m in，取樣時間為45m in；樣品前處理中加入3.6%氫氧化鈉溶液的體積由原來的5 m L改為20m L，加入磷酸的體積由原來的0.2m L改為0.7m L。采用高效液相色譜法測定制劑中雙氫青蒿素的溶出度：色譜柱為YMC-Pack ODS-A，流動相為0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調節pH為2.4）-乙腈（65∶35，V/V），流速為1.0m L/m in，檢測波長為237 nm，柱溫為30℃，進樣量為20μL。結果：雙氫青蒿素檢測質量濃度線性范圍為7.802～117.03μg/m L（r＝0.999 9）；定量限為2.0 ng，檢測限為0.6 ng；精密度、重復性試驗的RSD＜1.0%；回收率為99.18%～100.46%（RSD＝0.45%，n＝9）。3批樣品中雙氫青蒿素的平均溶出度分別為94.9%、77.9%、89.6%。結論：改進后的方法提高了其靈敏度、溶出度以及檢測結果的準確性。

雙氫青蒿素哌喹片；雙氫青蒿素；溶出度測定；方法改進

雙氫青蒿素哌喹片為雙氫青蒿素和磷酸哌喹的復方制劑。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物[1-2]，能迅速控制癥狀和殺滅瘧原蟲[3]。磷酸哌喹是一種長效抗瘧疾藥物[4]，能使滋養體食物泡膜和線粒體腫脹，導致其生理功能的破壞，從而殺死瘧原蟲[5]。體外藥效學研究顯示，雙氫青蒿素與磷酸哌喹合用具有協同作用[6]，可延緩瘧原蟲抗藥性的產生[7]。雙氫青蒿素哌喹片質量標準收載于2010年版《中國藥典》（第一增補本）[8]。但在實際操作中發現，雙氫青蒿素測定回收率偏低，溶出度測定結果也偏低。根據國家藥典委員會下達的全球基金項目國家藥品標準提高課題任務以及藥品生產企業對雙氫青蒿素哌喹片公示標準的反饋意見，為了更好地控制和評價企業產品質量，本課題組經試驗研究，通過在樣品前處理中增加3.6%氫氧化鈉溶液和磷酸的體積，使溶液中雙氫青蒿素衍生更加完全，以達到提高回收率和溶出度測定結果的目的。本研究改進的方法已收載于2015年版《中國藥典》（二部）[9]，現將有關情況報道如下。

1 材料

1.1 儀器

AT 7smart型溶出儀，包括CY7-50活塞泵及C613收集器（瑞士SOTAX公司）；ZKT-18型真空脫氣機（天津天大天發科技有限公司）；e2695型高效液相色譜（HPLC）儀，包括2489型紫外-可見吸收檢測器及Empower工作站（美國Waters公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200W，頻率：40 kHz）；BSA224S-CW型萬分之一電子天平及ME215S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

雙氫青蒿素哌喹片（華立巖康制藥有限公司，批號：010212、011110、010512，規格：每片含雙氫青蒿素40 mg、磷酸哌喹320mg）；雙氫青蒿素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100184-201202，純度：99.94%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調節pH為2.4）-乙腈（65∶35，V/V）；流速：1.0m L/min；檢測波長：237 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取雙氫青蒿素對照品20mg，置于50m L量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，精密量取適量，置于10m L量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，于37℃保溫45 m in，放冷至室溫，即得質量濃度為390.1μg/m L的對照品貯備液。取上述對照品貯備液5 m L，置于25m L量瓶中，用3.6%氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴中反應30m in，取出放冷至室溫，精密加入磷酸0.7m L，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，采用2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅩC“溶出度測定”第二法（槳法），以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質，溶出介質體積為500 m L，轉速為75 r/min，依法操作，于45min時取溶出液適量，作為供試品貯備液。取上述供試品貯備液5m L，置于25m L量瓶中，用3.6%氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴中反應30min，取出放冷至室溫，精密加入磷酸0.7m L，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方稱取輔料（含磷酸哌喹）適量，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞2.0；理論板數以雙氫青蒿素衍生物1峰計＞3 000，保留時間為4.65m in。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 m L，各置于50 m L量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，于37℃保溫45m in，放冷至室溫，即得系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各20μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以雙氫青蒿素質量濃度（x，μg/m L）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.000 03x－0.023 1（r＝0.999 9）。結果表明，雙氫青蒿素檢測質量濃度線性范圍為7.802～117.03μg/m L。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD）。結果，雙氫青蒿素的LOQ為2.0 ng，LOD為0.6 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，雙氫青蒿素峰面積的RSD＝0.20%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：010212）適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，雙氫青蒿素峰面積的RSD＝0.46%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

取低、中、高質量的雙氫青蒿素對照品適量，共9份，再按樣品的處方比例加入空白輔料（含磷酸哌喹）適量，分別置于500m L量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，各取適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表1。

2.9 溶出介質的選擇

取樣品（批號：010212）適量，分別以水、0.1mol/L鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質，溶出介質體積為500m L，轉速為75 r/m in，于5、15、30、45、60m in時取樣（同時補充相應的溶出介質10m L），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，考察樣品在4種溶出介質中的平均累積溶出度，結果見圖2。由圖2可知，樣品在4種溶出介質中的溶出行為均相似。但是在0.1mol/L鹽酸溶液中的各溶出時間點的平均累積溶出度均較高，因此選擇0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝9）

圖2 樣品在4種溶出介質中的溶出曲線Fig 2 Dissolution curvesof samples in 4 kindsof dissolutionmediums

2.10 轉速的確定

取樣品（批號：010212）適量，以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質，溶出介質體積為500m L，轉速分別為50、75 r/min，于5、15、30、45、60min時取樣（同時補充相應的溶出介質10m L），并按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，考察樣品在不同轉速、不同時間點的平均累積溶出度，結果見表2。由表2可知，75 r/min轉速的平均累積溶出度較好，因此選擇75 r/min為本試驗的轉速。

表2 樣品在不同轉速及不同時間點的平均累積溶出度（n＝6，%）Tab 2 Average accumulative dissolution of samplesat different rotation speeds and different time points（n＝6，%）

2.11 取樣時間的確定

取樣品（批號：010212）適量，共6份，以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質，溶出介質體積為500m L，轉速為75 r/m in，于5、15、30、45、60m in時取樣（同時補充相應的溶出介質10m L），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，考察樣品在不同時間點的平均累積溶出度，結果見圖3。由圖3可知，樣品在45 min時溶出曲線達到平臺期。

圖3 樣品在不同時間點的溶出曲線（n＝6）Fig 3 Dissolution curves of samples at different time points（n＝6）

2.12 濾膜吸附試驗

取“2.2.1”項下濾過前和濾過后的對照品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算吸附量。結果，0.45μm微孔濾膜對雙氫青蒿素的吸附量＜2.0%（n＝6），符合規定[10]。

2.13 樣品溶出度測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，用外標法以峰面積計算溶出度（要求≥標示量的70%）；同時，以2010年版《中國藥典》（第一增補本）的方法測定溶出度，結果見表3。

表3 樣品溶出度測定結果（n＝6，%）Tab 3 Results of dissolution determ ination of samples（n＝6，%）

3 討論

本課題組曾取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：010212）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，供試品溶液在室溫下放置2 h后，其中的雙氫青蒿素峰面積呈顯著遞減趨勢，因此本試驗制備的供試品溶液應在2 h內完成測定。

因為雙氫青蒿素存在α和β兩種差向異構體，在不同溶劑中溶解兩種異構體可能會相互轉換且雙氫青蒿素中無共軛結構和發色基團，不宜用分光光度法和HPLC法直接測定。考慮到雙氫青蒿素含內酯結構，在堿性條件下易水解，能得到更加穩定和紫外吸收更強的衍生物（雙氫青蒿素衍生物1和2）。故本試驗將樣品前處理中加入3.6%氫氧化鈉溶液體積由5 m L改為20 m L，加入磷酸的體積由0.2m L改為0.7m L，使其衍生更加完全，使其定量更準確；且所有方法學驗證試驗均按外標法以雙氫青蒿素衍生物1和2的峰面積之和計算結果。

按2010年版《中國藥典》（第一增補本）[8]方法測定，3批樣品的平均溶出度分別為83.1%、71.0%、86.8%；而按本試驗方法測定，3批樣品的平均溶出度分別為94.9%、77.9%、89.6%，溶出度測定結果顯示靈敏度明顯提高。

綜上所述，改進后的方法提高了其靈敏度、溶出度以及檢測結果的準確性。

[1] 韋國峰，何有成，黃祖良.雙氫青蒿素的制備及其含量測定[J].右江民族醫學院學報，2011，23（5）：691-692.

[2] 王滿元.青蒿素類藥物的發展歷史[J].自然雜志，2012，34（1）：44-47.

[3] 常明，張相林，劉曉，等.雙氫青蒿素人體藥動學及生物等效性研究[J].中國藥房，2006，17（14）：1086-1088.

[4] 劉昌輝，黃天來，洪馨，等.高效液相色譜法測定人血漿中磷酸哌喹[J].藥物分析雜志，2007，27（1）：63-65.

[5] 周琳.HPLC測定雙氫青蒿素哌喹片中的磷酸哌喹及有關物質[J].華西藥學雜志，2015，30（5）：610-612.

[6] 朱凱，范琦，張小松，等.HPLC測定雙氫青蒿素哌喹片中磷酸哌喹的含量[J].中國藥學雜志，2008，43（9）：713-714.

[7] 韓韜，代勇.簡述使用青蒿素聯合西藥治療瘧疾的研究進展[J].當代醫藥論叢，2015，13（6）：10-11.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：第一增補本[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2012：271.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：95.

[10] 國家食品藥品監督管理局.普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則[S].2009.

Improvement of Determ ination Method for the Dissolution of Dihydroartem isinin in Dihydroartem isinin and Piperaquine Phosphate Tablets

ZHANG M ian，LIChao（Chongqing Institute for Drug and Food Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To improve the detection method for the dissolution of dihydroartem isinin in Dihydroartem isinin and piperaquine phosphate tablets.METHODS：The dissolution experiment adopted paddlemethod using 0.1mol/L hydrochloric acid solution 500m L as solventw ith rotating speed of 75 r/m in and sampling time of 45m in.In sample pre-treatment，the volume of 3.6% sodium hydroxide solution was increased from 5 m L to 20 m L，and that of phosphoric acid was increased from 0.2 m L to 0.7 m L. HPLC was adopted to determ ine the dissolution of dihydroartem isinin.The determ ination was performed on YMC-Pack ODS-A column w ith mobile phase consisted of 0.02 mol/L disodium hydrogen phosphate solution（pH adjusted to 2.4 using phosphoric acid）-acetonitrile（65∶35，V/V）at the flow rate of 1.0m L/min.The detection wavelength was set at 237 nm，and column temperature was 30℃.The sample size was 20μL.RESULTS：The linear range of dihydroartem isinin were 7.802-117.03μg/m L（r＝0.999 9）.The limit of quantitation was2.0 ng，and the limit of detection was 0.6 ng.RSDsof precision and reproducibility testswere all lower than 1.0%.The recoverieswere 99.18%-100.46%（RSD＝0.45%，n＝9）.Average dissolutionsof dihydroartem isinin in 3 batchesof sampleswere 94.9%，77.9%，89.6%，respectively.CONCLUSIONS：Improved method enhance the accuracy for the lim it of sensitivity，dissolution and detection results.

Dihydroartem isinin and piperaquine phosphate tablets；Dihydroartem isinin；Dissolution determ ination；Method improvement

R 927.2

A

1001-0408（2017）15-2086-04

2016-05-31

2016-11-30）

（編輯：劉 柳）

全球基金項目國家藥品標準提高課題（No. GF2012.39）

＊主管藥師。研究方向：藥物分析。電話：023-86072743。E-mail：7183503@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.20