UPLC-QQQ/MS法檢測驢膠補(bǔ)血顆粒中的阿膠Δ

陳鴻玉，李勁平，李文莉，丁 野，孫 輝，楊 清，黃曉燕（.湖南省藥品檢驗研究院，長沙 4000；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙 4003）

UPLC-QQQ/MS法檢測驢膠補(bǔ)血顆粒中的阿膠Δ

陳鴻玉1，2＊，李勁平2#，李文莉1，2，丁 野1，孫 輝1，楊 清1，黃曉燕1（1.湖南省藥品檢驗研究院，長沙 410001；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410013）

目的：建立驢膠補(bǔ)血顆粒中阿膠的檢測方法。方法：采用胰蛋白酶對制劑中阿膠進(jìn)行酶解，并采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法檢測制劑中阿膠成分。色譜條件：色譜柱為HypersilGOLD C18，流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.3m L/m in，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5μL。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，離子化模式為電噴霧正離子化模式（多反應(yīng)監(jiān)測），檢測離子對為阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4和m/z 539.8（雙電荷）→923.8，噴霧電壓為3 100 V，鞘氣壓為20Arb，輔助氣壓為8Arb，離子傳熱管溫度為350℃，蒸發(fā)溫度為350℃，掃描模式為單離子檢測掃描，碰撞氣體為高純氬氣。結(jié)果：阿膠成分檢測質(zhì)量濃度線性范圍為20.24～2 024μg/m L（r＝0.997 8）；檢測限為1%；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜6.0%。27批樣品中均檢出阿膠特征分子離子峰。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，可用于驢膠補(bǔ)血顆粒中阿膠的檢測。

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法；驢膠補(bǔ)血顆粒；阿膠；特征分子離子峰

驢膠補(bǔ)血顆粒為由阿膠、黃芪、黨參、熟地黃、白術(shù)、當(dāng)歸6味藥材組方而成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血之功效，臨床用于久病氣血兩虛所致的倦怠乏力、面黃肌瘦、頭暈?zāi)垦５劝Y的治療[1]。方中阿膠為君藥，阿膠是由馬科動物驢的皮熬制而成的膠，具有滋陰補(bǔ)血之功效，為治療血虛之首選藥[2-3]。隨著阿膠的需求量日益增大及資源萎縮，致使該藥材摻偽造假問題嚴(yán)重，存在使用其他劣質(zhì)皮類替代驢皮熬制阿膠的違法行為[4-5]。近年來，相關(guān)研究針對阿膠藥材摻偽造假的問題建立了以特征肽段為指標(biāo)的專屬性檢測方法，該方法有效地應(yīng)用于打擊阿膠藥材摻偽造假違法行為[6-9]。然而，對于一些阿膠成藥摻偽摻假的情況仍缺乏專屬性檢測方法。本課題組研究的驢膠補(bǔ)血顆粒為2015年版《中國藥典》（一部）收載的含阿膠中成藥，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無與阿膠藥材相關(guān)的檢測項目[2]。為了提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的專屬性和可控性，本課題組采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-QQQ/MS）建立了其中阿膠的專屬性檢測方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000型 UPLC儀，包括 TSQ Endura QQQ/MS系統(tǒng)（美國Thermo Scientific公司）；CG-300型超聲波清洗儀（廣州比朗儀器有限公司，功率：300W，頻率：25 kHz）；AE240型電子分析天平、XSE205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

驢膠補(bǔ)血顆粒（湖南時代陽光藥業(yè)股份有限公司，批 號 ：20120410、20120510、20120901、20120921、20121006、20121015、20130145、20130209、20130409、20130507、20130910、20131129、20140312、20140508、20140803、20150215、20150301、20150310，規(guī)格：20 g/袋；九芝堂股份有限公司，批號：201306013、201309058、201310033、 201312006、 201403032、 201404019、201405025、201411086、201412014，規(guī)格：20 g/袋）；阿膠對照藥材（批號：121274-201202）、黃明膠對照藥材（批號：121695-201301）、鹿角膠對照藥材（批號：121694-201301）均購自中國食品藥品檢定研究院；豬皮膠對照藥材（筆者自制）；胰蛋白酶為質(zhì)譜級，甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HypersilGOLD C18（75mm× 2.1mm，1.8μm）；流動相：0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脫（0～6 min，95%→93%A；6～8 min，93%→10%A；8～9 m in，10%A；9～9.5 m in，10%→95%A；9.5～12 min，95%A）；流速：0.3m L/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；離子化模式：電噴霧正離子化模式，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測；檢測離子對：阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4和m/z 539.8（雙電荷）→923.8；噴霧電壓：3 100 V；鞘氣壓：20 Arb；輔助氣壓：8 Arb；離子傳熱管溫度：350℃；蒸發(fā)溫度：350℃；掃描模式：單離子檢測掃描[m/z539.8（雙電荷）→612.4，碰撞能量：16 V；m/z 539.8（雙電荷）→923.8，碰撞能量：20V]；碰撞氣體：高純氬氣。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照藥材溶液 稱取阿膠對照藥材0.1 g，置于350m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液40m L，超聲處理30m in，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，加胰蛋白酶溶液（取胰蛋白酶，加1%碳酸氫鈉溶液使溶解，制成質(zhì)量濃度為2μg/μL的溶液，臨用新配，下同）15μL，搖勻，37℃下恒溫酶解8 h，制成阿膠對照藥材溶液。同法制成黃明膠、豬皮膠、鹿角膠對照藥材溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，稱取1 g（約相當(dāng)于含阿膠0.1 g），置于50m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液40m L，超聲處理30m in，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，加胰蛋白酶溶液15μL，搖勻，37℃下恒溫酶解8 h，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按驢膠補(bǔ)血顆粒處方和工藝制備缺阿膠的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項下對照藥材溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，陰性對照色譜圖中，在與阿膠對照藥材和供試品相應(yīng)位置上無相應(yīng)色譜峰，表明陰性對照對阿膠成分檢測無干擾，方法專屬性良好。

圖1 特征分子離子峰色譜圖Fig 1 Characteristicmolecular ion peak chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取阿膠對照藥材0.101 2 g，置于50m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液40m L，超聲處理30m in，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，作為溶液A。精密量取溶液A 1、2、5、10、20m L，分別置于100m L量瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液100μL，置于10m L量瓶中，加胰蛋白酶溶液15μL，搖勻，37℃下恒溫酶解8 h，制成系列阿膠對照藥材溶液。精密量取上述系列阿膠對照藥材溶液各5μL，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度。以阿膠對照藥材溶液質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標(biāo)、離子信號相對強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝42 810x－5 053.3（r＝0.997 8）。結(jié)果表明，阿膠對照藥材溶液檢測質(zhì)量濃度線性范圍為20.24～2 024μg/m L。

2.5 檢測限考察

精密量取“2.2.1”項下阿膠對照藥材溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定。當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限為1%。

2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20150310）適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄離子信號相對強(qiáng)度。結(jié)果，m/z539.8（雙電荷）→612.4、923.8提取離子流峰保留時間的RSD＝0（n＝6）；m/z 539.8（雙電荷）→923.8、m/z539.8（雙電荷）→612.4提取離子流峰離子信號相對強(qiáng)度的RSD分別為4.53%、3.47%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20150310）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、15、24 h時按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度。結(jié)果，m/z 539.8（雙電荷）→612.4、923.8提取離子流峰保留時間的RSD＝0.10%（n＝6）；m/z 539.8（雙電荷）→923.8、m/z 539.8（雙電荷）→612.4提取離子流峰離子信號相對強(qiáng)度的RSD分別為2.97%、5.64%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20150310）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度。結(jié)果，m/z539.8（雙電荷）→612.4、923.8提取離子流峰保留時間的RSD＝0（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 樣品檢測

取27批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度。結(jié)果，27批樣品中均檢出阿膠特征分子離子峰。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在流動相方面，筆者主要考察了乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）、甲醇-水（梯度洗脫）、乙腈-水（梯度洗脫）、0.1%甲酸-乙腈溶液（梯度洗脫），結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）的分離效果和峰形較好。在柱溫方面，筆者考察了柱溫為25、30、35℃對色譜分離效果的影響，結(jié)果表明，柱溫對分離效果和峰形影響不大，本試驗選擇柱溫為30℃。在色譜柱方面，筆者考察了2個品牌的色譜柱，分別是Hypersil GOLD C18（75 mm×2.1 mm，1.8μm）和ACQUITY UPLC BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm），結(jié)果前者分離效果較好。

3.2 酶解時間、酶量和酶解溫度的考察

筆者參照2015年版《中國藥典》（四部）“通則3405肽檢查法”中的溶劑條件，考察酶解時間和酶量[10-12]。在37℃恒溫水浴中，于酶解8、12、16、20、24 h時分別進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)酶解8、12 h時阿膠特征分子離子峰離子信號相對強(qiáng)度一致，因此選擇8 h作為酶解時間。將樣品和酶比例分別設(shè)置為800∶3（m/m）、800∶6（m/m）、800∶9（m/ m），發(fā)現(xiàn)當(dāng)比例為800∶6（m/m）和800∶9（m/m）時，阿膠特征分子離子峰離子信號相對強(qiáng)度一致，考慮盡量降低成本，故選擇比例為800∶6（m/m）。酶解溫度選擇30、37、45℃進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)37℃時阿膠特征分子離子峰離子信號相對強(qiáng)度最大，故選擇酶解溫度為37℃。

3.3 提取溶劑pH的考察

提取溶劑分別選擇1%碳酸氫鈉溶液（甲酸調(diào)pH至6.0）、1%碳酸氫鈉溶液、1%碳酸氫鈉溶液（氨試液調(diào)pH至9.0），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣。結(jié)果，1%碳酸氫鈉溶液阿膠特征分子離子峰離子信號相對強(qiáng)度最大。故選擇其作為提取溶劑。

3.4 特征分子離子的選擇

在本課題組的前期研究中[5-9]，以主成分分析法找出阿膠與龜甲膠、鹿角膠、黃明膠、新阿膠的區(qū)別，并通過偏最小二乘法分析找出特征分子離子。故本試驗中以m/z 539.8（雙電荷）→612.4、923.8為樣品中阿膠的特征分子離子。

3.5 耐用性考察

筆者主要考察了UltiMate 3000/TSQ Endura QQQ/ MS儀、API 5500 QQQ/MS儀、Waters I-Class/Xevo TQD QQQ/MS儀。結(jié)果表明，3個品牌QQQ/MS儀檢測供試品的m/z539.8（雙電荷）→923.8和m/z539.8（雙電荷）→612.4提取離子流色譜圖中，同時出現(xiàn)與阿膠特征分子離子峰保留時間相同的色譜峰，說明本方法的耐用性較好[13-14]。

綜上所述，本方法專屬性強(qiáng)，可用于驢膠補(bǔ)血顆粒中阿膠的檢測。

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Determination of Donkey-hide Gelatin in Lüjiao Buxue Granulesby UPLC-QQQ/MS

CHEN Hongyu1，2，LIJinping2，LIW enli1，2，DING Ye1，SUN Hui1，YANG Qing1，HUANG Xiaoyan1（1.Hunan Provincial Institute for Drug Control，Changsha 410001，China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Central South University，Changsha 410013，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the determ ination of donkey-hide gelatin in Lüjiao buxue granules.METHODS：Trypsin was used for enzymatic hydrolysis of donkey-hide gelatin.UPLC-QQQ/MS was adopted for the determ ination of donkey-hide gelatin in the preparation：Hypersil GOLD C18column wasused w ith mobile phase consisted of 0.1%form ic acid solution-acetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.3 m L/m in.The column temperature was 30℃，and sample size was 5μL. Mass chromatography condition was that ion source was electrospray ion source；ionization mode was ESI+；multiple responsemonitoring was adopted，and characteristic molecular ion peaks of donkey-hide gelatin w ith mass-to-charge ratio of m/z 539.8（double charge）→ 612.4 and m/z 539.8（double charge）→ 923.8 were used as detection ion pair.Spray voltage was 3 100 V；sheath gas was20 Arb；auxiliary gaswas 8 Arb；ion transfer tube temperature was350℃；evaporation temperature was 350℃；scan mode was SRM.Collision gaswas high purity argon.RESULTS：The sample size of donkey-hide gelatin ranged 20.24-2 024μg/m L（r＝0.997 8）.The detection lim it was 1%.RSDs of precision，stability and reproducibility testswere all lower than 6.0%.The characteristic molecular ion peaks of donkey-hide gelatin could be detected in 27 batches of samples.CONCLUSIONS：The method is specific and can be used for the determ ination of donkey-hide gelatin in Lüjiao buxue granules.

UPLC-QQQ/MS；Lüjiao buxue granules；Donkey-hide gelatin；Characteristicmolecular ion peak

R927

A

1001-0408（2017）15-2101-04

2016-06-24

2016-11-05）

（編輯：張 靜）

國家科技重大專項課題（No.2014ZX09304307）；湖南省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技項目（No.湘食藥科R201504）

＊主管藥師。研究方向：藥物分析與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：649409690@qq.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物分析與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0731-82650340。E-mail：pjingli@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.24