HPLC法測定注射用泮托拉唑鈉中的有關(guān)物質(zhì)

張 靜，翟麗杰，高立娜（吉林大學第二醫(yī)院藥學部，長春 130041）

HPLC法測定注射用泮托拉唑鈉中的有關(guān)物質(zhì)

張 靜＊，翟麗杰#，高立娜（吉林大學第二醫(yī)院藥學部，長春 130041）

目的：建立測定注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為KromasilHypersilODS，流動相為0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液（調(diào)節(jié)pH為7.0）-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0m L/m in，檢測波長為290 nm，柱溫為40℃，進樣量為20μL。結(jié)果：雜質(zhì)A、B、C+E、D檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.416 8～1.042 0μg/m L（r＝0.999 8）、0.195 0～0.487 5μg/m L（r＝0.999 9）、0.389 0～0.972 5μg/m L（r＝0.999 8）、0.198 6～0.496 5μg/m L（r＝0.999 8）；定量限分別為0.834、0.780、1.556、0.794 ng/m L，檢測限分別為0.417、0.390、0.778、0.397 ng/m L；精密度試驗的RSD＜1.0%，重復性試驗中總雜質(zhì)峰面積的RSD＜1.0%；回收率分別為98.81%～102.49%（RSD＝1.18%，n＝9）、95.31%～98.44%（RSD＝0.91%，n＝9）、96.88%～98.44%（RSD＝0.52%，n＝9）、97.87%～101.28%（RSD＝1.05%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡便、準確，可用于注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)的測定。

高效液相色譜法；注射用泮托拉唑鈉；有關(guān)物質(zhì)；測定

泮托拉唑鈉由德國百克頓（Gulden）公司開發(fā)上市，是繼奧美拉唑、蘭索拉唑之后的新一代質(zhì)子泵抑制劑（PPI），為消化性潰瘍的一線治療藥[1-6]。在全球上市后，因其抑酸作用強而持久、潰瘍愈合率高、不良反應少和藥物相互作用少的顯著優(yōu)勢，迅速成為治療與胃酸有關(guān)的消化系統(tǒng)功能紊亂性疾病的特效藥物。其與奧美拉唑和蘭索拉唑相比，對質(zhì)子泵具有更高的選擇性，抑制胃酸的分泌達到一個新水平，療效明顯占優(yōu)。目前，該制劑已被新版《中國藥典》[7]、《英國藥典》[8]、《美國藥典》[9]和《歐洲藥典》[10]收載。而《英國藥典》《美國藥典》《歐洲藥典》收載的僅有泮托拉唑鈉原料藥標準，無注射用無菌粉末標準；而《中國藥典》中雖收載了泮托拉唑鈉原料藥和注射用無菌粉末標準，但是并沒有對各雜質(zhì)作相應的限度要求。因此，本研究參考相關(guān)文獻[7]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括LC-20AD XR二元梯度泵、SIL 20A HT自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPDM 20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；FE20K型酸度計（瑞士Mettler-Toledo公司）；ZH-2型旋渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；M illi-Q Advantage A10型超純水儀（美國M illipore公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用泮托拉唑鈉[石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司，批號：C058131101、C058131102、C058131103，規(guī)格：60mg/支]；注射用泮托拉唑鈉（原研藥，德國奈科明制藥有限公司，批號：203869，規(guī)格：40mg/支）；泮托拉唑鈉對照品（批號：20140511，純度：99%）、雜質(zhì)A對照品（批號：20140511，純度：99%）、雜質(zhì)B對照品（批號：20140511，純度：99%）、雜質(zhì)C對照品（批號：20140511，純度：99%）、雜質(zhì)E對照品（批號：20140511，純度：99%）均購自深圳達爾森科技有限公司；雜質(zhì)D對照品（美國Waters公司，批號：20140511，純度：99%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil Hypersil ODS（125mm×4.0mm，5μm）；流動相：0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液（調(diào)節(jié)pH為7.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～40min，80%→20%A；40～45min，20%→80%A）；流速：1.0m L/m in；檢測波長：290 nm；柱溫：40℃；進樣量為20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取泮托拉唑鈉對照品和雜質(zhì)A、B、C、D、E對照品各約1mg，分別置于10m L量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖勻，即得泮托拉唑鈉和雜質(zhì)A、B、C、D、E的單一對照品貯備液。分別量取上述泮托拉唑鈉單一對照品貯備液1m L，雜質(zhì)A單一對照品貯備液80μL，雜質(zhì)B、C、D、E單一對照品貯備液各40μL，置于同一10m L量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，置于25m L量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對照溶液 取處方比例輔料適量（約相當于泮托拉唑鈉4mg處方所需輔料量），置于100m L量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、泮托拉唑鈉對照品各適量，置于5m L量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液、系統(tǒng)適用性溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各待測有關(guān)物質(zhì)均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以泮托拉唑鈉峰計為15 800，保留時間為11.025min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 破壞性試驗

圖1 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability and specificity test

按如下方法制備各破壞樣品溶液——（1）酸破壞樣品溶液：取樣品適量（約相當于泮托拉唑鈉40mg），置于100m L量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶液12m L，于室溫下靜置10min，加適量0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和，再加0.001mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（2）堿破壞樣品溶液：取樣品適量（約相當于泮托拉唑鈉40mg），置于100m L量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液12m L，振搖使其全部溶解，于室溫下放置1 h，加適量1mol/L鹽酸溶液中和，再加0.001mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）高溫破壞樣品溶液：取樣品適量（約相當于泮托拉唑鈉40mg），置于圓皿內(nèi)，于120℃加熱40min，取出，冷卻至室溫，置于100m L量瓶中，加0.001mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（4）高濕破壞樣品溶液：取樣品適量（約相當于泮托拉唑鈉40mg），置于平皿內(nèi)，開口置于盛有硝酸鉀飽和溶液的密閉容器中（濕度為92.5%），于25℃條件下放置72 h，置于100m L量瓶中，加0.001mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（5）光照破壞樣品溶液：取樣品適量（約相當于泮托拉唑鈉100mg），置于平皿內(nèi)，開口置于（7 500±500）lx強光下照射72 h，置于100m L量瓶中，加0.001mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

取上述破壞樣品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，樣品在酸、堿、高溫、高濕、光照條件下均有不同程度的降解，雜質(zhì)峰有所增多，但各降解雜質(zhì)峰與主成分峰之間以及各降解雜質(zhì)峰之間分離良好（分離度均＞1.5）。

2.5 線性關(guān)系考察

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogramsofdestructive test

范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.6 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得雜質(zhì)A、B、C+E、D的定量限（LOQ）分別為0.834、0.780、1.556、0.794 ng/m L；當信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD）分別為0.417、0.390、0.778、0.397 ng/m L。

2.7 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C+E、D峰面積的RSD分別為0.03%、0.03%、0.06%、0.05%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：C058131101）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，供試品溶液中只檢出雜質(zhì)A和雜質(zhì)C+E，雜質(zhì)A峰面積的RSD＝0.22%（n＝6），雜質(zhì)C+E峰面積的RSD＝0.17%（n＝6），總雜質(zhì)峰面積的RSD＝0.98%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

從聯(lián)盟初創(chuàng)期特征來看，各BIM聯(lián)盟在分析內(nèi)外部條件基礎上，確定各自戰(zhàn)略目標、尋找合作伙伴，簽署聯(lián)盟協(xié)議和綱領(lǐng)文件，設立專家?guī)臁⒊闪＜椅瘑T會，制定發(fā)展規(guī)劃、技術(shù)路線，開展標準研究制定、課題研究、人才培養(yǎng)、互動交流等工作。但對于聯(lián)盟技術(shù)突破性創(chuàng)新、全產(chǎn)業(yè)鏈深度合作、利益分配共享、風險共擔、資金投入、市場占領(lǐng)等內(nèi)容并未充分涉及。

分別量取“2.2.1”項下雜質(zhì)A、B、C、D、E的單一對照品貯備液各適量，置于同一10 m L量瓶中，加0.001 mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。按上述方法制備低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Resultsof recovery test（n＝9）

2.10 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取4批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中含有關(guān)物質(zhì)的量，結(jié)果見表3。由表3可知，3批國產(chǎn)樣品均只檢測出兩個已知雜質(zhì)，即雜質(zhì)A以及雜質(zhì)C+E，并均＜0.2%，總雜質(zhì)＜1.0%；原研藥樣品中雜質(zhì)C+E含量＞0.2%，雜質(zhì)A未達到檢測限。

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Resultsof related substancesdeterm ination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 柱溫的選擇

筆者考查了不同柱溫（30℃和40℃）對樣品分離的影響。結(jié)果表明，不同柱溫的測試結(jié)果均符合系統(tǒng)適用性要求，保留時間無明顯差別；但柱溫40℃條件下各峰對稱性、分離度及柱效更好，更有利于樣品的分離。因此，本試驗的柱溫選擇為40℃。

3.2 流動相A的pH考察

筆者考查了流動相A的不同pH（6.5、7.0和7.5）對樣品中已知雜質(zhì)分離的影響。結(jié)果表明，流動相A的pH為6.5時，雜質(zhì)A與主峰無法分離；流動相A的pH為7.5時，雜質(zhì)C+E與雜質(zhì)D無法完全分離；而流動相A的pH為7.0時，各雜質(zhì)與主峰以及各雜質(zhì)間的分離均較好。故本試驗選擇流動相A的pH為7.0。

3.3 穩(wěn)定性試驗

本試驗曾進行穩(wěn)定性試驗，考察了供試品溶液（批號：C058131101）在室溫下放置0、1、2、3、4 h時的總雜質(zhì)峰面積。結(jié)果，總雜質(zhì)峰面積在4 h內(nèi)明顯增加，表明進行有關(guān)物質(zhì)測定時，供試品溶液應在制備后立即測定，以免對測定結(jié)果產(chǎn)生不必要的干擾。

3.4 雜質(zhì)C+E的考察

注射用泮托拉唑鈉中的雜質(zhì)C為5-（二氟甲氧基）-2-｛（RS）-[（3，4-二甲氧基-2-吡啶基）甲基]亞磺酰基｝-1甲基-1H-苯駢咪唑，雜質(zhì)E為6-（二氟甲氧基）-2-｛（RS）-[（3，4-二甲氧基-2-吡啶基）甲基]亞磺酰基｝-1甲基-1H-苯駢咪唑，雜質(zhì)C是以雜質(zhì)B（硫醚）為起始原料經(jīng)過氧化物氧化得到的，其與雜質(zhì)E互為異構(gòu)體，無法完全分離[9-10]。本文參考《歐洲藥典》和《美國藥典》系統(tǒng)適用性標準[9-10]，測定雜質(zhì)C和E時，以其總量C+E表示，作為同一雜質(zhì)考慮。

綜上所述，本方法簡便、準確，可用于注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)的測定。

[1] 李軍，部敬順，張鑒.注射用泮托拉唑鈉的穩(wěn)定性考察[J].中國藥房，2005，16（21）：1655-1657.

[2] 孫丹，朱嫻.注射用泮托拉唑鈉在各注射液中配伍的穩(wěn)定性考察[J].化工中間體，2015（10）：114-115.

[3] 王麗云，呂旭幸.注射用泮托拉唑鈉的雜質(zhì)含量及其雜質(zhì)譜的比較[J].抗感染藥學，2015，12（4）：499-504.

[4] 蔣鵬，錢新毅.質(zhì)子泵抑制藥：泮托拉唑[J].醫(yī)藥導報，2003，22（3）：184-186.

[5] 王婧斯，李桂龍，王成港，等.泮托拉唑鈉有關(guān)物質(zhì)分析方法的比較[J].藥物評價研究，2012，35（2）：109-112.

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[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：704-706.

[8] British Pharmacipoeia Comm ission Office.British Pharmacopoeia 2015：VolumeⅡ[S].2015：494.

[9] The United Stated Pharmacipoeia Commission Office.The United Stated Pharmacopoeia：37[S].2015：3264.

[10] European Pharmacipoeia Comm ission Office.European Pharmacopoeia：8.0[S].2015：4680.

（編輯：劉 柳）

Determ ination of Related Substances in Pantoprazole Sodium for Injection by HPLC

ZHANG Jing，ZHAILijie，GAO Lina（Dept.of Pharmacy，the Second Hospital of Jinlin University，Changchun 130041，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of related substances in Pantoprazole sodium for injections.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil Hypersil ODS column w ith mobile phases consisting of 0.01 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution（pH adjusted to 7.0）-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 m L/m in.The detection wavelength was set at 290 nm，and the column temperature was 40℃，and injection volume was 20μL.RESULTS：The linear ranges of impurity A，impurity B，impurity C+E，and impurity D were 0.416 8-1.042 0 μg/m L（r＝0.999 8），0.195 0-0.487 5μg/m L（r＝0.999 9），0.389 0-0.972 5μg/m L（r＝0.999 8），0.198 6-0.496 5μg/m L（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantitation were 0.834，0.780，1.556，0.794 ng/m L；the limits of detection were 0.417，0.390，0.778，0.397 ng/m L，respectively.RSD of precision testwas lower than 1.0%；in repetitive test，RSD for total peak area of impurity was lower than 1.0%；the recoveries were 98.81%-102.49%（RSD＝1.18%，n＝9），95.31%-98.44%（RSD＝0.91%，n＝9），96.88%-98.44%（RSD＝0.52%，n＝9）and 97.87%-101.28%（RSD＝1.05%，n＝9）.CONCLUSIONS：Themethod is convenient，accurate and suitable for the determ ination of related substance in Pantoprazole sodium for injection.

HPLC；Pantoprazole sodium for injection；Related substances；Determ ination

R927

A

1001-0408（2017）15-2142-04

2016-08-18

2016-12-19）

＊主管藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。電話：0431-88796629。E-mail：jingwei_zhang@sina.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。電話：0431-88796413。E-mail：109788809@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.35