銀杏葉提取物對肝纖維化模型大鼠的影響及抗肝纖維化機制的研究

尚瑞 吳軍 鄭雪皎

·論著·

銀杏葉提取物對肝纖維化模型大鼠的影響及抗肝纖維化機制的研究

尚瑞 吳軍 鄭雪皎

目的 探討銀杏葉提取物(GBE)對肝纖維化模型大鼠的影響及抗肝纖維化機制。方法 SD大鼠60只隨機分為正常組(n=12)和模型組(n=48)，模型組大鼠又分為4個亞組：模型對照組、GBE低、中、高劑量組(n=12)，GBE低、中、高劑量組每天分別灌胃給予GBE 50 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg,正常組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，連續2個月(1次/d)。給藥結束后腹主動脈取血，分離血清，試劑盒檢測肝功能指標(ALT、AST、MDA、SOD、白蛋白、球蛋白及白/球)，放免法檢測肝纖維化指標(HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN)，大鼠脫頸椎處死后立即取右葉部分肝組織，液氮速凍后于-80℃保存，RT-PCR檢測肝組織 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型膠原mRNA的表達水平。結果 與模型對照組比較，GBE中、高劑量組AST、ALT、球蛋白及肝纖維化各項指標顯著降低，TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型膠原mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，白蛋白水平、白/球值顯著升高(P<0.05)，MDA水平差異無統計學意義(P>0.05)。結論 GBE能顯著改善肝纖維化大鼠的肝功能指標，肝纖維化指標，其機制可能是通過降低TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型膠原mRNA表達水平來實現的。

銀杏葉提取物；肝纖維化；RT-PCR；TGF-β1；TIMP1；Ⅰ型膠原

肝纖維化是各種慢性病發展過程中，肝內膠原增生與分解失調導致過多膠原異常沉積于肝的過程，常由于細胞壞死或炎癥刺激產生[1，2]。其發展結果為肝硬化的形成，隨著國內外學者對肝纖維化的重視，中藥治療肝纖維化的作用也有了突破性進展，有研究發現，銀杏葉提取物(GBE)含有抗組織纖維病變的成分[3-5]。因此,本研究通過觀察GBE對肝纖維化大鼠各項相關指標的觀察,探討銀杏提取物對肝纖維化模型大鼠的影響及抗肝纖維化機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級大鼠60只，雄性，體重180～220 g(湖北醫學實驗動物中心提供)，許可證號：SCXK(鄂)2014-0095。

1.2 藥物與試劑 銀杏葉提取物(GBE,購于武漢諾見生物技術有限公司,批號:060092)，其中黃酮苷24.6%，銀杏內酯6.11%;CCL4(鄭州化學試劑廠,批號:20160325);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司，批號分別為20160520、20160621、20160515、20160605;總蛋白(批號:161523),白蛋白(批號:160106),均購自廣州威佳科技有限公司;透明質酸(HA，批號：20160315)、PC-Ⅲ(Ⅲ型前膠原，批號：20160712)、Ⅳ型膠原(C-Ⅳ，批號：20160605)、層粘連蛋白(LN，批號：20160421)試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司；橄欖油(上海化學試劑廠，批號：974623)；總RNA提取試劑盒(Trizol,批號:160525)、逆轉錄試劑盒(MmlV,批號:RR053A)，及PCR反應試劑盒(批號:20150620)均購自大連寶生物工程有限公司,TGF-β及、金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP1)、Ⅰ型膠原mRNA引物均由大連寶生物工程有限公司設計。

1.3 儀器 KDC-220HR高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司);多功能酶標儀(美國鉑金埃爾默有限公司);Forma-85℃冰箱(美國Thermo公司);Stepone Plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司);普通PCR儀(美國PE公司)。

1.4 方法

1.4.1 肝纖維化大鼠模型建立[6]:60只SD大鼠隨機分為正常組(n=12)和模型組(n=48)，模型組大鼠每周3次皮下注射40%CCL4橄欖油溶液(5 ml/kg),連續造模6周,正常組給予等量橄欖油。

1.4.2 分組及給藥:模型組48只大鼠分為模型對照組(n=12)，GBE低(n=12)、中(n=12)、高(n=12)劑量組，GBE低、中、高劑量組分別灌胃給予GBE 50 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg,模型對照組給予等量的0.9%氯化鈉溶液,連續給藥2個月(1次/d)。給藥結束后水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，脫頸椎處死后，立即取右葉部分肝組織，于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱待用。

1.4.3 樣品處理及指標檢測:①肝功能檢測：腹主動脈取血，4℃,3 000 r/min離心,分離上層血清檢測:a.肝損害程度指標AST、ALT;b.肝細胞蛋白合成功能相關指標：白蛋白及總蛋白并計算白球蛋白比;c.抗氧化相關指標:MDA及SOD，所有操作均嚴格按照試劑盒說明進行。②肝纖維化指標檢測：放免法檢測血清HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平，所有操作均嚴格按照試劑盒說明進行。③RT-PCR測定肝組織 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型膠原mRNA的表達水平：將-80℃冰箱保存的肝組織按試劑盒說明書進行勻漿,抽提RNA,PCR反應條件為TGF-β1:起始預變性 94℃ 5 min,開始循環 94℃ 30 s,57℃30 s,72℃ 45 s,循環32次,72℃延伸 10 min,4℃保存。TIM P1和Ⅰ型膠原于95℃預變性3 min,開始循環:95℃30 s,57℃30 s,4℃保存待測。見表1。

表1 熒光定量PCR TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型膠原mRNA引物反應序列

2 結果

2.1 行為學觀察 造模后，模型組大鼠狀態萎靡，活動減少，靜臥，毛色暗淡，煩躁，飲水量及食量減少，處死取肝臟發現肝臟粗糙晦暗，觸摸有硬感，GBE低、中、高劑量組癥狀較輕。

2.2 肝功能相關指標檢測

2.2.1 肝損害程度指標ALT及AST水平變化:與正常組比較,模型對照組血清ALT及AST水平顯著升高(P<0.05)。與模型對照組比較，GBE中劑量及高劑量組ALT水平顯著高于模型對照組(P<0.01)；GBE低、中及高劑量組AST水平顯著高于模型對照組(P<0.05)。見表2。

組別ALTAST正常組22.26±5.3739.95±6.63模型對照組80.19±9.22*82.45±12.36*GBE低劑量組71.16±6.3167.39±7.11#GBE中劑量組56.38±5.59#51.17±4.92#GBE高劑量組31.19±4.17#43.22±3.69#

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型對照組比較,#P<0.05

2.2.2 肝細胞蛋白合成功能相關指標變化:與正常組比較,模型對照組血清白蛋白水平及白/球蛋白比值顯著降低(P<0.05)；球蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與模型對照組比較，GBE中劑量及高劑量組白蛋白水平及白/球蛋白比值顯著高于模型對照組(P<0.05)；球蛋白水平顯著高于模型對照組(P<0.05),球蛋白水平明顯低于模型對照組(P<0.05)。見表3。

表3 血清白蛋白、球蛋白水平及白/球值的變化 ±s

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型對照組比較,#P<0.05

2.2.3 抗氧化相關指標MDA和SOD水平變化:與正常組比較,模型對照組血清SOD水平顯著升高(P<0.01)，MDA水平變化差異無統計學意義(P>0.05)。與模型對照組比較，GBE低劑量、中劑量及高劑量組SOD水平顯著低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05),MDA水平變化差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

組別MDA(μmol/ml)SOD(nmol/ml)正常組93.63±3.191.53±0.46模型對照組94.11±2.473.52±1.01*GBE低劑量組92.94±5.161.96±0.33#GBE中劑量組93.87±4.132.21±0.47#GBE高劑量組94.70±3.172.96±0.39#

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型對照組比較,#P<0.05

2.2.4 肝纖維化指標檢測情況:與正常組比較,模型對照組血清HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平顯著升高(P<0.01)。與模型對照組比較，GBE低劑量、中劑量及高劑量組血清PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平顯著低于模型對照組(P<0.05)；GBE中劑量及高劑量組HA水平顯著低于模型對照組(P<0.05)。見表5。

組別HA(ng/dl)PC-Ⅲ(ng/dl)C-Ⅳ(U/ml)LN(ng/dl)正常組151.37±33.6776.09±14.1858.13±9.6335.07±6.62模型對照組433.82±76.10*229.11±37.12*101.24±13.67*105.47±15.54*GBE低劑量組371.65±67.43186.13±29.62#87.10±12.17#81.06±11.63#GBE中劑量組302.14±61.42#142.23±31.17#71.06±10.19#63.17±12.17#GBE高劑量組221.17±49.96#106.52±26.31#62.54±13.17#47.16±5.97#

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型對照組比較,#P<0.05

2.2.5 肝組織 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型膠原mRNA表達水平檢測結果:與正常組比較,模型對照組肝組織TGF-β1,TIMP1及I型膠原mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型對照組比較，GBE低劑量、中劑量及高劑量組肝組織TGF-β1、TIMP1及Ⅰ型膠原mRNA表達水平顯著低于模型對照組(P<0.05)。見圖1,表6。

圖1 肝組織 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型膠原 m RNA 的表達水平變化

組別TGF-β1TIMP1Ⅰ型膠原正常組0.51±0.050.92±0.090.4±0.12模型對照組0.53±0.10*3.91±0.25*0.75±0.22*GBE低劑量組0.54±0.39#2.41±0.80#0.23±0.07#GBE中劑量組0.52±0.23#1.95±0.21#0.62±0.11#GBE高劑量組0.51±0.01#1.2±0.02#0.31±0.09#

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型對照組比較,#P<0.05

3 討論

肝纖維化是各種慢性病發展過程中，肝內膠原增生與分解失調導致過多膠原異常沉積于肝的過程，常由于細胞壞死或炎癥刺激產生。隨著國內外對肝纖維化的重視，氧自由基及脂質過氧化已成為肝纖維化研究的重點課題。銀杏葉在臨床上用藥已久，銀杏葉提取物的指標性成分黃酮及銀杏內酯具有清除氧自由基等作用[7,8]。因此,本研究通過觀察GBE對肝纖維化大鼠各項相關指標的觀察,探討GBE對肝纖維化模型大鼠的影響及抗肝纖維化機制。

血清ALT和AST是肝損傷的主要標志。當發生肝損害時，ALT和AST活性顯著升高，球蛋白升高,白蛋白及白/球比值下降,且血清ALT和AST水平與肝損傷程度呈正相關。本研究結果顯示，GBE干預后，肝纖維化模型大鼠血清ALT水平、白蛋白水平及白/球蛋白比值顯著高于模型對照組(P<0.05)；GBE低劑量,中劑量及高劑量組AST及球蛋白水平。提示銀杏葉提取物可以減輕肝損傷。

脂氫過氧化物的產物丙二醛(MDA)及過氧化物歧酶是檢測脂質過氧化的主要標志[9-11]，其血清水平可間接反應機體受自由基損傷程度，本研究結果顯示GBE低劑量、中劑量及高劑量組SOD水平顯著低于模型對照組(P<0.05),MDA水平無明顯變化。提示銀杏葉提取物減輕肝損傷與SOD有關。

肝纖維化是肝內膠原增生與分解失調導致過多膠原異常沉積于肝的過程。蛋白多糖、膠原蛋白及粘連蛋白是肝纖維化的主要參與者。PC-Ⅲ(Ⅲ型膠原的前體),HA(透明質酸)及LN(層粘連蛋白)是這三種參與者的代表，肝細胞損傷的嚴重程度與這三種成分在體內的沉積成正相關，血清中PC-Ⅲ、HA及LN水平可以反映它們在肝部的沉積情況，可以反映肝纖維化的程度[12,13]。此外，Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)是組成基底膜的主要成分，是最先增生的膠原，且轉換率快，與肝纖維化程度密切相關，臨床上檢測這些項目指標可以基本上判定肝纖維化的程度[14,15]。本研究結果顯示，GBE低劑量、中劑量及高劑量組血清PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平顯著低于模型對照組(P<0.05)；GBE中劑量及高劑量組HA水平顯著低于模型對照組(P<0.05)。提示GBE可明顯減輕肝纖維化程度。

研究顯示，肝纖維化時，大量細胞因子被激活后釋放，激活桿星狀細胞(HSC)產生膠原等胞外基質,導致胞外基質過度沉積，細胞因子在肝纖維化中的作用逐漸凸顯，轉化生長因子β1(TGF-β1)被證明是發生肝纖維化的關鍵，MMPs是胞外基質降解所需的主要酶,它主要受TIMPs所調控,TIMPs表達水平升高可直接抑制MMPs的合成,從而消除胞外基質的沉積[16]。因此，降低 MMPs 的表達水平,增加TIMP1的表達水平已成為減少肝纖維化發生的新課程。本實驗研究顯示，GBE低劑量、中劑量及高劑量組肝組織TGF-β1、TIMP1及Ⅰ型膠原mRNA表達水平顯著低于模型對照組(P<0.05)，提示GBE抗肝纖維化作用可能是通過MMPs/TIMP1/TGF-β1通路來實現的。

綜上所述，GBE能顯著改善肝纖維化大鼠的肝功能指標，肝纖維化指標，其機制可能是通過降低TGF-β1、TIMP1,Ⅰ型膠原mRNA表達水平來實現。

1 Bhacecioglu IH.Protectiveeffect of Gikngobilo biloba extract on CCL4 idnuced Liver damage.He Patology Research,1999,15:215-224.

2 陳奇主編.中藥藥效研究思路與方法.第1版.北京:人民衛生出版社,2015.511-519.

3 Wu Z,Smiht JV,Paramsivam V,et al.Gikngo biloba extract increase stress resisatnce and exetnds life span of Caenorhabditis elegans.Cell Mol Biol,2002,48:725-731.

4 Gohil K,Packer L.Bioflvaoonid-rich botanical extracts show ntioxldant and gene Regulatory activity.Ann N Y Acad Sci,2002,97:70-77.

5 Lee KS,Lee SJ,Park HJ,et al.Oxidative stress effect on the activation of hepatic stellate cells.Yonsei Med J,2001,42:1-8.

6 Albanis E,Friedman SL.Hepatic fibrosis:Pathogenesis and principles of therpy.Clin Liver Dis,2001,5:314-315.

7 Paroda M,Robino G.Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis.J Hepatic,2001,35:297-306.

8 孔憲濤，高峰.肝纖維化的實驗與臨床研究.第二軍醫大學學報，1996,17:1-5.

9 陳東風，劉為紋.大鼠實驗性肝纖維化過程中血清和肝組織PC-Ⅲ,HA,及LN水平的動態變化.第三軍醫大學學報,1996,18:234-235.

10 陳東風，冷恩仁，劉為紋，等.血清Ⅲ型膠原、透明質酸、層粘連蛋白對慢性肝病的診斷價值.解放軍醫學雜志，1996,6:214.

11 畢紅征，薛敬禮，趙君玫，等.顆粒對肝纖維化大鼠血清透明質酸、Ⅲ型前膠原、層粘連蛋白及羥脯氨酸含量的影響.河南中醫,2006,26:26-28.

12 潘繼承，朱建一，呂志剛，等.Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、透明質酸及層粘連蛋白在診斷肝纖維化中的意義.臨床檢驗雜志,2005,23:143-144.

13 徐川，董云旭，單鴻，等.在CCL4誘導的大鼠肝臟纖維化模型型中肝功、肝臟纖維化程度的監測.中國實驗診斷學,2007,11:1137-1139.

14 劉濤，胡晉紅，蔡濤.苦參堿抗肝纖維化機理的體外研究.解放軍藥學學報,2000,16:119-122.

15 方步武，劉平，劉成.蟲草多糖抗免疫損傷型太鼠肝纖維化的作用及其機理研究.上海中醫雜志,2000,45:31.

16 徐列明，劉成，劉平，等.扁桃甙對大鼠肝貯質細胞增殖和產生膠原的影響.新消化病雜志，1997,15:84-85.

Effects of extract of ginkgo biloba leaf on liver fibrosis of rats and its action mechanism against liver fibrosis

SHANGRui*,WUJun*,ZHENGXuejiao.

DepartmentofDigestiveSystemDiseases,People’sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicineCollege,Hubei,Shiyan442000,China

Objective To investigate the effects of extract of ginkgo biloba leaf (GBE) on liver fibrosis of rats, and to explore its action mechanism against liver fibrosis.Methods Sixty SD rats were randomly divided into normal control group (n=12) and model group (n=48).The rats in model group were redivided into four subgroups:model control group, low-dose GBE group,median-dose GBE group and high-dose GBE group,with 12 rats in each group. The rats in three GBE groups were given GBE 50mg/kg,100mg/kg,200mg/kg, respectively by gavage,however,the rats in normal control group and model control group were given equal volume of 0.9% sodium chloride solution,once a day for 2 months.After administration, the serum levels of ALT,AST,MDA,SOD,albumin,globulin (albumin/globulin) were detected by Kit.The liver fibrosis indexes including HA,PC-Ⅲ,C-Ⅳ and LN were measured by radioimmunoassay.After the rats were sacrificed,the right lobe of the liver tissue was taken out,and the expressin levels of TGF-β1,TIMP1,type Ⅰ collagen mRNA were detected by RT-PCR.Results As compared with those in model control group,the serum levels of AST,ALT,globulin and hepatic fibrosis indexes in median-dose GBE group and high-dose GBE group were significantly decreased,and the expression levels of TGF-β1,TIMP1 and type Ⅰ collagen mRNA were significantly decreased too (P<0.05).However the levels of albumin and the ratio of albumin/globulus were significantly increased (P<0.05),but the levels of MDA were not changed obviously.Conclusion The extract of ginkgo biloba leaf can significantly improve liver function indexes and hepatic fibrosis indexes of rats with liver fibrosis,and its action may be completed by reducing the expression level of TGF-β1,TIMP1 and type Ⅰ collagen mRNA.

extract of ginkgo biloba leaf;hepatic fibrosis; RT-PCR; TGF-β1; TIMP1; type Ⅰ collagen

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.13.002

442000 湖北省十堰市，湖北醫藥學院附屬人民醫院消化內科(尚瑞、吳軍)，藥學部(鄭雪皎)

吳軍，442000 湖北省十堰市，湖北醫藥學院附屬人民醫院消化內科；

E-mail：jun1839@163.com

R 349.31

A

1002-7386(2017)13-1930-04

2016-12-26)