IGF-1轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)兔脛骨牽張成骨實(shí)驗(yàn)研究

吳衛(wèi)賓，任志勇，宋君，張維彬，魏長月

（1.陽光融和醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 261000；2.中國人民解放軍第89醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 261021）

因外傷等各種原因致四肢長骨大段缺損較為常見，臨床上有較多的方法治療，而Ilizarov技術(shù)是由前蘇聯(lián)醫(yī)學(xué)專家Gavriil Ilizarov于1952年設(shè)計(jì)并初步應(yīng)用于臨床。該技術(shù)的理念是在損傷肢體用鋼針貫穿固定骨骼的幾個(gè)平面，Ilizarov外固定器連接固定，但需較長的外固定時(shí)間，有骨質(zhì)疏松、針道感染等各種并發(fā)癥存在。而解決并發(fā)癥則需縮短外固定架的固定時(shí)間，然而牽張成骨區(qū)成骨質(zhì)量必須盡早接近或達(dá)到正常就顯得尤為重要。近年來組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，IGF-1在成骨于骨生長中起到非常重要的骨代謝平衡調(diào)節(jié)，參與了整個(gè)生命周期[1,2]。Johansson等[3]發(fā)現(xiàn)IGF-1既可增加成骨細(xì)胞的合成、分泌，又可加強(qiáng)破骨細(xì)胞的功能，但對(duì)成骨細(xì)胞作用更強(qiáng)，使骨質(zhì)增多，骨密度增加。任志勇等[4]在實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)兔脛骨模型牽張成骨應(yīng)用骨形態(tài)蛋白2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞證明了有促進(jìn)骨形成及提高骨質(zhì)量作用。因此，我們通過分別將兔脛骨干骺端截骨，應(yīng)用Ilizarov技術(shù)制作兔脛骨牽張成骨模型，在固定期內(nèi)第2天實(shí)驗(yàn)組分別注入IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于兔脛骨牽張延長區(qū)間隙內(nèi)，驗(yàn)證IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植是否有促進(jìn)對(duì)兔脛骨牽張成骨骨形成質(zhì)量的作用，并為臨床提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康新西蘭白兔48只，體重（2.5±0.2）kg，（9±1）周齡，雄性，由中國人民解放軍第89醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康新西蘭白兔隨機(jī)分三組，每組16只，A組為實(shí)驗(yàn)組：固定期第2天于牽張成骨區(qū)間隙內(nèi)注入IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞200μL。B組為對(duì)照組：于牽張成骨區(qū)間隙內(nèi)注入相同濃度200μL自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。C組為空白組：牽張成骨區(qū)間隙內(nèi)不注入任何物質(zhì)。

1.2.2 兔自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

隨機(jī)取16只新西蘭白兔并依次標(biāo)號(hào)1-16號(hào)，用5 mL注射器，取稀釋的肝素(1×104U/L)1 mL，肌肉注射。消毒后在兔股骨大粗隆頂點(diǎn)用實(shí)驗(yàn)骨髓穿刺針抽取股骨骨髓4 mL，直接加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL中，置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度為37℃。3 d后更換一次，半量，此后每2天換液1次，方法同上。80%細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，完全去掉上清液。沖洗：用PBS沖洗1遍后，加入0.25%胰蛋白酶消化2 min等待細(xì)胞變圓后，再加含血清DMEM液終止消化，吹打細(xì)胞，將兔自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)傳代至第P3代細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

1.2.3 真核質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染兔自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

利用重組大腸桿菌擴(kuò)增并提取足夠數(shù)量空載質(zhì)粒、重組質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)染48 h后的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞FITC標(biāo)記后在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IGF-1后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在熒光鏡下呈現(xiàn)綠色，而未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組未見熒光反應(yīng)（圖 1 ，2）。

圖1 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-IGF-1（FITC標(biāo)記×20）

圖2未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（FITC標(biāo)記×20）

1.2.4 動(dòng)物模型的制作

無菌條件下進(jìn)行，肌注氯胺酮麻醉。沿兔左脛前內(nèi)側(cè)縱行切開中上1/3皮膚及皮下組織，鈍性分離脛前肌，暴露脛骨，在脛骨粗隆下約1.0 cm水平處截骨，分別在截骨面上下各0.5～1.0 cm處穿放兩組平行克氏針，將雙邊外固定架給予固定。截?cái)嚯韫牵p合、包扎。術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后青霉素肌肉注射預(yù)防感染。術(shù)后1周開始延長遠(yuǎn)端穿骨模塊，每天牽張1.0 mm，分2次進(jìn)行，牽張長度共1.0cm。固定期第2天，將相應(yīng)編號(hào)IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞200 uL注入兔脛骨模型A組的牽張延長間隙內(nèi)；B組在牽張延長間隙給予注入相應(yīng)編號(hào)相同濃度的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；C組不予任何物質(zhì)注入。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 影像學(xué)觀察

各組分別在固定期的第2周末，第6周末行兔左側(cè)脛骨模型全長X線透視，觀察牽張成骨延長區(qū)的成骨情況。

1.3.2 HE染色觀察

固定期第2，6周末在牽張成骨區(qū)內(nèi)取材，HE染色，切成50 um厚切片，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.3.3 骨密度測(cè)定

于第3個(gè)月末取各組6只動(dòng)物標(biāo)本，用Hologic QDR-2000雙能X線骨密度儀(中國人民解放軍第89醫(yī)院影像科)測(cè)定骨密度。

1.3.4 結(jié)構(gòu)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

第3個(gè)月末取各組6只動(dòng)物標(biāo)本，用CSS-4000萬能材料測(cè)試儀(中國人民解放軍第89醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）行承受負(fù)荷強(qiáng)度、結(jié)構(gòu)剛度、能量吸收結(jié)構(gòu)生物力學(xué)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)檢查

固定期第2周末：X線片示三組牽張成骨兔脛骨模型正位片上，對(duì)位對(duì)線良好。三組延長區(qū)均可見低密度骨痂形成影像，骨痂密度A組略高于B組及C組（圖3）。

圖3 固定期第2周末X線表現(xiàn)

圖4 固定期第6周末X線表現(xiàn)

圖5 固定期第2周末HE染色（HE染色×200）

圖6 固定期第6周末HE染色（HE染色×100）

固定期第6周末：X線片示三組牽張成骨兔脛骨模型正位片上，對(duì)位對(duì)線良好。牽張成骨延長區(qū)三組新骨形成的數(shù)量及骨密度明顯增加，填充于整個(gè)牽張成骨延長區(qū)，骨痂影似由延長區(qū)間隙的兩端向中央生長，兩端有骨皮質(zhì)征象。延長區(qū)可見少量新骨影，呈片狀及條索狀排列。在X線片上顯示A組較B組及C組亮度高（圖4）。

2.2 HE染色觀察

固定期第2周末：顯示A組有少量纖維軟骨骨痂形成，B組及C組無纖維軟骨骨痂形成，炎性細(xì)胞及破骨細(xì)胞均減少（圖5）。

固定期第6周末：三組均有成熟骨基質(zhì)及骨小梁，但A組較B組及C組骨細(xì)胞增生活躍，軟骨肥厚帶增大，成骨細(xì)胞明顯可見密度增加、骨細(xì)胞肥大、鈣鹽沉積均勻，軟骨骨痂已向骨性骨痂轉(zhuǎn)變（圖6）。

2.3 骨密度測(cè)定

牽張成骨固定期3個(gè)月后各組隨機(jī)取6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本，Hologic QDR--2000雙能X線骨密度儀測(cè)定骨密度，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)程序在電子計(jì)算機(jī)上對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A組骨密度相對(duì)值（%）顯著高于B組與C組P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組與C組對(duì)比P＞0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨密度值由高到低順序排列為：A組＞B組＞C組(表1)。說明胰島素樣生長因子1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在兔脛骨牽張成骨實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)骨生成。

2.4 生物力學(xué)測(cè)試

牽張成骨固定期3個(gè)月后各組取6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本行骨密度測(cè)定，使用CSS-4000萬能材料測(cè)試儀行生物力學(xué)測(cè)定。測(cè)定承受負(fù)荷強(qiáng)度、結(jié)構(gòu)剛度、能量吸收各項(xiàng)指標(biāo)，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)程序行統(tǒng)計(jì)分析，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果示：A組優(yōu)于B組和C組P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組與C組對(duì)比，P＞0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組載荷強(qiáng)度最大(表2)。生物力學(xué)測(cè)試數(shù)值由高到低順序排列為：A組＞B組＞C組。說明IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在兔脛骨牽張成骨實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)骨生成的質(zhì)量。

表1 骨密度測(cè)試結(jié)果(±s)

表1 骨密度測(cè)試結(jié)果(±s)

Group n BMD相對(duì)值（%）A組 6 47.9±23.1 B組 6 28.9±21.2 C組 6 26.8±22.3

表2 結(jié)構(gòu)生物力學(xué)差數(shù)(±s)

表2 結(jié)構(gòu)生物力學(xué)差數(shù)(±s)

Group n 最大負(fù)荷（N） 結(jié)構(gòu)剛度（N·mm-1） 能量吸收（N·mm）A 組 6 187.35±11.68 207.66±35.73 209.73±26.51 B 組 6 173.87±21.54 189.17±38.34 170.66±29.31 C 組 6 169.97±29.34 185.82±40.53 169.75±20.67

3 討論

1905年意大利學(xué)者Codivila曾報(bào)道骨延長術(shù)；Ilizarov研究發(fā)現(xiàn)了牽張應(yīng)力對(duì)組織生長再生的刺激作用，即牽張?jiān)偕?guī)律。Hamdy等[5]發(fā)現(xiàn)延長區(qū)出現(xiàn)牽引縱軸方向排列的膠原纖維和骨小梁，鈣化從兩端逐漸向中心。Cope等[6]的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)兩端向延長區(qū)中心逐漸鈣化，纖維組織和新生的骨小梁也逐漸增多，在延長后的第42天左右，則可見相對(duì)成熟的再生骨組織。Aronson等[7]研究觀察肢體延長區(qū)的細(xì)胞增殖現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)中利用增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）發(fā)現(xiàn)骨延長區(qū)增殖細(xì)胞呈區(qū)域分布，細(xì)胞的增殖與牽拉作用有關(guān)。Ilizarov外固定器連接固定，用于創(chuàng)傷及矯形方面如骨折、骨缺損、肢體延長、關(guān)節(jié)問題等。牽張成骨過程中成骨區(qū)在牽張期與固定早期骨質(zhì)脆弱，使該項(xiàng)技術(shù)需較長的外固定時(shí)間，然而有骨質(zhì)疏松、針道感染等各種并發(fā)癥存在。這些存在的問題一直讓我們探究。

IGF-1具有內(nèi)分泌和旁分泌特性的單鏈多肽因子，幾乎參與體內(nèi)每個(gè)器官的生長和功能[8-10]。在青春期和成年期IGF-1骨骼發(fā)育和成熟方面都起到重要作用，分別參與長骨生長、骨成熟、鈣質(zhì)在骨骼中的沉積和保持骨質(zhì)密度[11,12]的過程。在出生后及整個(gè)青春期，IGF-1和生長激素兩個(gè)因子對(duì)長骨的發(fā)育成熟都起著至關(guān)重要的作用[13，14]，IGF-1促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化是多樣性的，可以通過不依賴促有絲分裂的途徑，影響骨代謝。IGFs還可以顯著增加骨吸收與骨形成的偶聯(lián)作用。鑒于IGF在成骨中的重要作用，科學(xué)研究人員將外源性生長因子應(yīng)用于牽張成骨或骨折愈合區(qū)，從而加速骨創(chuàng)傷修復(fù)愈合過程，但由于外源性生長因子半衰期短，加之提取困難，價(jià)格昂貴等限制性因素的存在，應(yīng)用效果不盡人意。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有免疫原性，且具有取材創(chuàng)傷小、儲(chǔ)備多、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)IGF-1基因介導(dǎo)后植入牽張成骨區(qū)后可很好地存活增殖，并持續(xù)分泌IGF-1，可以很好地避免外源性生長因子應(yīng)用的限制因素。應(yīng)用符合Ilizarov骨牽張技術(shù)理念外固定架固定，在固定期內(nèi)第2天于牽張間隙內(nèi)注入IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，驗(yàn)證IGF-1基因介導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)兔脛骨牽張成骨骨形成質(zhì)量是否有促進(jìn)作用未見文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

成骨質(zhì)量與多方面有密切關(guān)系，非介入的影像檢查是常用的臨床檢測(cè)手段，臨床常據(jù)此評(píng)估骨愈合的質(zhì)量，決定何時(shí)可以安全地拆除外固定器，目前常規(guī)的X線片還是最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。我們于固定期的第2周末，第6周末對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別行牽張成骨區(qū)X線攝片。在X線片上顯示實(shí)驗(yàn)組明顯較對(duì)照組及空白組亮度高。我們同時(shí)在固定期的第2周末及第6周末將牽張成骨區(qū)骨組織作了HE染色觀察。除此之外我們還在本實(shí)驗(yàn)中行骨密度及生物力學(xué)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于對(duì)照組及空白組。因此我們推斷經(jīng)IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌IGF-1對(duì)牽張區(qū)成骨質(zhì)量有明顯的促進(jìn)作用?？傊?，本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到牽張成骨區(qū)，通過干細(xì)胞的增殖分泌IGF1促進(jìn)牽張成骨區(qū)成骨質(zhì)量。但I(xiàn)GF-1相互作用復(fù)雜且與多環(huán)節(jié)相關(guān)，目前還需我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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