顯微介導河蟹總DNA導入鏡鯉的檢測與分析

閆學春，欒培賢，何立川

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，淡水水產(chǎn)生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

顯微介導河蟹總DNA導入鏡鯉的檢測與分析

閆學春，欒培賢，何立川

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，淡水水產(chǎn)生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用顯微介導遠緣雜交技術將河蟹總DNA直接導入鏡鯉受精卵內(nèi)，再利用AFLP分子標記技術檢測顯微介導河蟹基因鏡鯉的外源DNA。在30對AFLP引物中，有3對引物擴增出供體基因片段，即在顯微介導河蟹基因鏡鯉中均有和河蟹基因相同而對照鏡鯉沒有的條帶。對6尾陽性顯微介導河蟹基因鏡鯉的擴增產(chǎn)物進行回收、克隆和測序驗證。結果表明：陽性顯微介導河蟹基因在鏡鯉中均含有供體基因目的片段。本研究在分子和基因水平上驗證了河蟹總DNA可通過顯微介導方式整合到鏡鯉基因組中，為顯微介導外源總DNA轉(zhuǎn)化技術的應用提供新的思路。

顯微介導；河蟹；總DNA；鏡鯉

遠緣雜交（distanthybridization）是親緣關系較遠的種間、屬間的生物個體間雜交，可促進種屬間的基因交流，創(chuàng)造新物種[1]，是魚類育種基本手段之一[2,3]。而顯微介導遠緣雜交技術就是利用外源總DNA導入技術，將超遠緣異源供體總DNA導入受體基因組來改善鯉科魚類的品質(zhì)。顯微介導遠緣雜交與轉(zhuǎn)化載體構建的基因工程不同，而機理與自然的漸滲雜交有相同之處，都是實現(xiàn)外源DNA分子片段的雜交，其供體染色體和受體染色體很少發(fā)生配對現(xiàn)象[4-6]。利用供體基因資源進行遠緣雜交可以引入大量具有供體性狀的功能基因，特別是一些新基因有可能重組進入受體，而進入受體的供體遺傳物質(zhì)可以調(diào)控基因表達，如啟動子、增強子等[7,8]。利用轉(zhuǎn)基因技術將供體基因組DNA導入受體基因組中而實現(xiàn)外源基因片段的雜交，克服種屬間遠緣雜交的不親和性、雜種不育，而外源基因的高水平表達可以克服品質(zhì)性狀的低遺傳力特征，使供體的優(yōu)良性狀在受體魚中得以體現(xiàn)，可以有計劃有目的的選擇供體總DNA片段[9]。利用顯微介導總DNA導入技術產(chǎn)生有供體片段存在的大量原代和子代個體，再結合分子標記輔助育種技術，可加快魚類品種改良和新種產(chǎn)生的過程。

德國鏡鯉CyprinuscarpioL.鱗片少，核型與鯉核型基本一致，從原西德引進后，經(jīng)多年的系統(tǒng)選育，已成為我國主要的鯉養(yǎng)殖品種之一。德國鏡鯉由于生長速度超過其他鯉，已被全國水產(chǎn)良種審定委員會審定為適合在我國推廣的水產(chǎn)優(yōu)良養(yǎng)殖品種[10,11]。河蟹（中華絨螯蟹）Eriocheir sinensis肉味鮮美，營養(yǎng)價值豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素和維生素A，是優(yōu)良的遺傳資源[12,13]。如果將這些有益的營養(yǎng)特性導入鏡鯉，創(chuàng)造出新的鏡鯉品種，對獲得一個肉質(zhì)優(yōu)良鏡鯉養(yǎng)殖新品種很有幫助。

本研究通過對顯微介導河蟹基因的鏡鯉進行AFLP分析，在分子水平和基因水平上證明顯微介導河蟹基因鏡鯉已整合了河蟹DNA，從而證明本方法的實際應用效果，為淡水養(yǎng)殖魚類的改良提供一種全新的途徑和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

河蟹購于哈爾濱市水產(chǎn)市場，鏡鯉取自黑龍江水產(chǎn)研究所松浦試驗站。顯微介導河蟹基因鏡鯉由黑龍江水產(chǎn)研究所遺傳育種與生物技術研究室制備。

1.1.2 引物與試劑

在上海生工生物技術服務有限公司購買Taq酶和T4-DNA連接酶；在大連寶生物公司購買DNA Marker（DL2000）；接頭及引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供合成。AFLP接頭和通用引物序列及選擇性引物序列見表1。

表1 AFLP接頭及引物序列Tab.1 Adapter and primer sequences of AFLP

1.1.3 河蟹總DNA的制備

河蟹基因組DNA的提取依毛瑞鑫等的方法[12]稍加改動。取約100mg河蟹肌肉經(jīng)液氮磨碎，放入1.5mL離心管中；在管中加入 500μL緩沖液（100mmol/LNaCl；10mmol/LTris-Cl，pH8.0；100mmol/L EDTA，pH8.0）混勻，再加入終質(zhì)量濃度為0.5μg/mL的SDS和100μg/mL的蛋白酶K；在55℃水浴鍋內(nèi)消化至液體透明；待冷卻后加入等體積的飽和酚（pH8.0）抽提1次，用酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提1次；離心后提取上清液，加入2倍體積的冷凍無水乙醇沉淀DNA，收集絮狀沉淀；70%的乙醇洗滌沉淀 2次，7 500r/min離心5min，自然干燥后加入TE溶解。取出其中的l管DNA，用超聲波（TH-800B型數(shù)控超聲波儀）打斷大片段DNA，將樣品DNA稀釋至終濃度200ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試驗魚基因組DNA提取

顯微介導河蟹基因鏡鯉DNA的提取方法參見閆學春等[14]。在加有裂解液的試管中加入100mg鰭條，55℃消化，中間不時輕輕搖動，待組織完全消化后取出，加入酚-氯仿混合液抽提2次；加入RNA酶，37℃保溫30min，再用等體積氯仿抽提1次，然后透析16h，直至透析液OD270＜0.05，加入2倍體積的無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌1次，自然干燥，加入0.1×TE溶解，置4℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 外源基因?qū)?/p>

參見閆學春等[15]。每年5～6月繁殖季節(jié)，選擇性成熟的鏡鯉親魚，注射鯽腦垂體和促黃體釋放激素類似物的混和合物進行人工催產(chǎn)，采集一定數(shù)量的高質(zhì)量鏡鯉卵子和4℃冰箱中保存的精液，進行干法授精，受精卵分散粘附在培養(yǎng)皿上，以國產(chǎn)可三維移動的顯微操作儀，用自制的玻璃注射針給1～2細胞期的鏡鯉受精卵顯微注射。每個受精卵注射量為1nL。對照受精卵僅注射生理鹽水。注射后的鯉受精卵于22～23℃水族箱孵化，同時用氣泵充氣直至出膜。共導入鏡鯉受精卵1 600粒，獲得試驗魚288尾，放入池塘強化培育。

1.2.2 AFLP試驗

AFLP試驗采用閆學春等[15]的方法。

1.2.2.1 酶切反應

在37℃水浴中，利用Mse I/Eco R I對DNA樣品雙酶切（3～6h），電泳檢測酶切效果（1%的瓊脂糖凝膠），再將DNA樣品放于65℃水浴20min（使酶失活），4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 連接反應

連接反應體系包括T4-DNA連接酶2μL，酶切DNA樣品 4μL，MseⅠ接頭 1.0μL，Eco RⅠ接頭1.0μL，PEG 2μL，Buffer2μL，加無菌水至反應總體積20μL。16℃連接過夜。

1.2.2.3 預擴增反應

PCR反應條件為：72℃2min，94℃30s，56℃30s，72℃2min，共30個循環(huán)，72℃溫育10min。反應混合液體系為：Buffer 18μL，MseⅠ引物（M-C 10mmol/L）1μL，Eco RⅠ引物（E-A 10mmol/L）1μL，Taq酶（5U/μL）0.3μL，無菌水2.7μL。在23μL反應混合液中加入連接產(chǎn)物2μL。PCR擴增后用無菌水稀釋40倍，-20℃保存。

1.2.2.4 選擇性擴增反應

反應混合液為：Buffer 18μL，MseⅠ引物（10mmol/L）1μL，Eco RⅠ引物（10mmol/L）1μL，Taq酶（5U/μL）0.3μL，2μL稀釋的預擴增產(chǎn)物，無菌水2.7μL，反應體積為25μL。PCR反應條件：先94℃ 2min，再94℃30s，65℃30s（每循環(huán)退火溫度降低0.7℃），72℃90s，13個循環(huán)后變?yōu)椋?4℃30s，56℃30s，72℃90s，23個循環(huán)。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

參見閆學春等[15]的方法。緩沖液為：98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青。6%的變性聚丙烯酰胺配制為：丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺19∶1，7mol/L尿素，1×TBE。利用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測選擇性擴增產(chǎn)物。AFLP擴增產(chǎn)物加入等體積的上樣緩沖液，經(jīng)95℃變性10min后，立即冰浴，每個樣品上樣量為5μL，上樣前（凝膠55W恒功率條件下）預電泳30min至溫度達到55℃。電泳結束后銀染、照相、分析。

2 結果與分析

2.1 顯微介導河蟹基因鏡鯉基因組DNA提取

提取的顯微介導河蟹基因鏡鯉基因組DNA的OD260/OD280為1.8～2.0（紫外分光光度計和EB染色的熒光強度雙重測定），所測個體DNA含量為3～4μg/μL。瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳檢測結果顯示：DNA條帶清晰無彌散現(xiàn)象，表明提取的顯微介導河蟹基因鏡鯉基因組DNA純度高，蛋白質(zhì)和RNA等雜質(zhì)含量少，可以用于AFLP后續(xù)試驗（圖1）。

圖1 顯微介導河蟹基因鏡鯉基因組DNA瓊脂糖電泳Fig.1 Agarose electrophoresis of the genom ic DNA in m irror carpm icro-injected w ith Chinese m itten handed crab genom ic DNA

2.2 顯微介導河蟹基因鏡鯉AFLP擴增

以河蟹基因組DNA為陽性對照，以普通鏡鯉基因組DNA為陰性對照，檢測59尾顯微介導河蟹基因鏡鯉基因組。在30對AFLP引物中，有3對引物對25尾顯微介導河蟹基因鏡鯉擴增出供體基因片段，即和河蟹基因相同的帶，而對照鏡鯉沒有，陽性率為42.37%。圖2是引物E-ACC，M-CTT擴增顯微介導河蟹基因鏡鯉的結果，箭頭所指是擴增的供體基因組片段。

圖2 顯微介導河蟹基因鏡鯉的AFLP電泳圖Fig.2 AFLP electrophoresis of the genom ic DNA in m irror carp m icro-injected w ith Chinesem itten handed crab genom ic DNA

2.3 顯微介導河蟹基因鏡鯉產(chǎn)物凝膠測序

在AFLP試驗結果中，顯微介導河蟹基因鏡鯉與河蟹有相同的條帶，而在對照鏡鯉中沒有的目的條帶進行回收，回收產(chǎn)物濃度均為20ng/μL。對其中6尾陽性顯微介導河蟹基因鏡鯉的擴增產(chǎn)物進行回收、克隆和測序驗證。結果表明：陽性顯微介導河蟹基因鏡鯉中均含有供體基因目的片段（圖3）。

圖3 供體基因序列與顯微介導河蟹基因鏡鯉序列比對Fig.3 Sequence alignments of donor and the genom ic DNA in m irror carp m icro-injected w ith Chinesem itten handed crab genom ic DNA

3 討論

AFLP是由荷蘭科學家Pieter Vos等[16]于1995年發(fā)明的一種DNA分子標記，基因組經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割、連接接頭，再進行PCR擴增，每個反應能提供大量的多態(tài)性片段。該方法信息含量大、效率高，無需Southern雜交，沒有放射源的風險，已廣泛應用在魚類研究中。如Rubinstein等[17]研究AFLP分子標記在斑馬魚Barchydaniorerio的野生型和突變體不同組織及發(fā)育時期的表達；Young等[18]利用476個 AFLP分子標記構建虹鱒Oncorhynchus mykiss遺傳連鎖圖譜，經(jīng)過遺傳連鎖分析分別得到主連鎖群和小連鎖群32個和11個；王志勇等[19]用5對AFLP引物對大黃魚Larimichthyscrocea野生種群和養(yǎng)殖群體進行分析，野生種群和養(yǎng)殖種群在多態(tài)性比例和個體遺傳差異存在顯著差異，野生種群顯著高于養(yǎng)殖群體；David等[20]利用AFLP技術對兩個鯉CyprinuscarpioL.種群進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)AFLP的多態(tài)性在草魚Ctenopharyngodonidella和鯉中為6.7%，而在觀賞鯉中為59.9%。說明草魚和鯉與被檢測的其他魚有相當遠的親緣關系；劉必謙等[21]利用AFLP技術把岱衢族大黃魚分為岱衢族大黃魚Ⅰ型和Ⅱ型；季士治等[22]為開展大鱗鲆分子研究，建立AFLP分子體系。利用AFLP技術在外源基因的檢測方面也得到應用。佟廣香等[23]利用AFLP技術評估轉(zhuǎn)基因鯉的生態(tài)安全性，檢測不同比例轉(zhuǎn)基因鯉親本子一代基因組的分子遺傳學特征，結果表明逃逸轉(zhuǎn)基因鯉數(shù)量與生態(tài)安全直接相關；閆學春等[15]利用AFLP技術對顯微介導中國對蝦Fenneropenaeuschinensis基因鯉進行外源DNA檢測，證明受體鯉中含有供體基因片段。本研究所獲得的AFLP指紋圖譜表明：顯微介導河蟹基因鏡鯉中存在河蟹特異性AFLP指紋，表明河蟹的供體基因成功滲入到受體鏡鯉基因組中。為進一步找到精確的遺傳證據(jù)，本研究將與河蟹相同的AFLP條帶進行回收、測序。結果表明：顯微介導河蟹基因鏡鯉片段序列與供體片段序列完全一致，進一步證明河蟹基因在受體鏡鯉中存在的可靠性。

依靠顯微介導遠緣雜交技術，導入的外源基因和其他轉(zhuǎn)基因魚的的操作方法是一樣的，都采用顯微注射方法，其優(yōu)勢在于所導入的外源基因是未經(jīng)遺傳修飾的基因組DNA。用這種方法得到的魚與遠緣雜交相近，只不過是基因組水平的遠緣雜交。該技術方法簡便，不受受體水產(chǎn)動物種類限制，可任意選擇當家優(yōu)良品種進行外源DNA導入，為遠緣雜交不親和的水產(chǎn)動物之間的基因重組創(chuàng)造了條件。而周光宇等[4]針對遠緣雜交提出假說，即“DNA片段雜交假說”。該假說提出，遠緣雜交通過與母本DNA部分同源的DNA片段重組進入母本，實現(xiàn)遠遠雜交，使母本性狀出現(xiàn)變異。供體總DNA在顯微介導的輔助下導入母本，并且包含全部供體遺傳信息，因此存在發(fā)生遠緣雜交概率。在對與魚類品質(zhì)相關基因知之甚少的情況下，通過顯微介導外源總DNA的轉(zhuǎn)化，將一些有益營養(yǎng)特性基因?qū)膈帲偻ㄟ^對后代的篩選，就可以獲得擁有高品質(zhì)的新性狀個體。

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Detection and Analysis of Mirror Carp Micro-injected with Total DNA in Chinese Mitten Handed Crab

YAN Xue-chun,LUAN Pei-xian,HE Li-chuan
（National Local JointEngineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding,Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding,Heilongjiang River FisheriesResearch Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In thisstudy,totalDNA of Chinesemitten handed crab（Eriocheirsinensis）was injected intomirror carp（Cyprinuscarpio）bymicro-injected distanthybridization technique,and the exogenous DNA inmirror carpmicro-injected Chinesemitten handed crab wasdetected by AFLPmolecularmarker technology.In the30 pairsof AFLPprimers,3 pairsof primershave amplified thegene fragmentsof donor,indicating that there is themicro-injected Chinesemitten crab gen found in only crab.The results showed that,cloned and sequenced amplification products revealed that there were transgene fragments in all the positive three scales of 6 positivemicro-injectedmirror carp.The findings verified that the totalDNA of crab was injected into three scales genome atmolecular and gene levels,providing a new strategy for theapplication ofm icro-injected exogenous totalDNA.

m icro-injected;Chinesem itten handed crab;totalDNA;m irror carp

Q959；S917

A

1005-3832（2017）03-0019-05

2017-02-06

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（HSY201707M）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目(2011AA100404)；國家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺項目.

閆學春(1964-)，男，研究員，從事分子生物學與基因工程育種研究.E-mail:yanxc8@163.com