2016年諾貝爾生理或醫學獎背景下的細胞死亡方式再認識

鄧過房

摘 要 細胞死亡是生物界普遍存在的現象，細胞死亡的方式多種多樣，重點介紹細胞程序性死亡（PCD）中的兩種細胞死亡方式：細胞凋亡和細胞焦亡。

關鍵詞 細胞凋亡 細胞焦亡

中圖分類號 Q-49 文獻標志碼 E

2016年10月3日北京時間17：30，諾貝爾基金會宣布將2016年的諾貝爾生理學或醫學獎授予大隅良典教授，以表彰他在自噬反應領域做出的卓越貢獻。自噬反應屬于Ⅱ型細胞凋亡類型。細胞死亡是生物界普遍存在的現象，不同于機體死亡。正常組織中，每天都有千千萬萬個細胞死亡，生物體主要通過嚴格控制細胞死亡和細胞增殖之間的平衡來調控細胞數量和質量。細胞死亡的方式通常有2種：細胞壞死、細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。基于機制可以將程序性細胞死亡分為兩大類：Caspase（半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶）依賴的和Caspase非依賴的，前者包括典型的細胞凋亡和新發現的細胞焦亡。下面重點介紹“細胞凋亡與細胞焦亡”這兩種細胞死亡方式。

1 細胞凋亡

細胞凋亡一詞最早是由英國的病理學家科爾和希臘語教授馬克于1972年提出的。在希臘語中，apo的意思是脫離，ptosis的意思為落下，將這兩個詞組合（apoptosis）用來描述與秋葉落下和花兒凋謝類似的細胞死亡現象。到1990年，細胞凋亡的研究獲得了里程碑式的重大進展，證明了細胞凋亡是基因調控的主動過程，典型的細胞凋亡過程涉及一系列Capase的水解、活化和信號傳遞過程。

1.1 細胞凋亡的形態學特征

細胞皺縮，細胞間的連接消失，同時細胞間的密度增加，核質濃縮成一個或幾個大的包團，染色質遷移至核膜周邊形成新月形凝集，細胞核裂解為碎塊，進而細胞膜內陷自行分割成幾個由細胞膜包裹的，表面光滑的凋亡小體；DNA被特異性的核酸內切酶分解成180～220 bp的片斷，瓊脂糖電泳出現特征性的DNA梯狀區帶，在細胞凋亡早期需要大量的ATP。

根據細胞的形態學變化，可將細胞凋亡分為3個階段：

① 凋亡開始。細胞表面的微絨毛、細胞突起及細胞表面的褶皺等特化結構消失，但細胞膜依然完整，沒有失去選擇通透性；線粒體大體保持完整，但偶爾也見到線粒體變大，嵴增多；內質網囊腔膨脹擴大；細胞骨架的結構有時變得致密和紊亂；染色質濃縮，分布在核膜周圍或一側，呈眼球狀。

② 凋亡小體的形成。凋亡小體的產生有兩種方式。一種為發芽脫落方式：首先染色體斷裂為大小不等的片斷，然后通過發芽起泡，與一些細胞器聚集在一起，形成一球形的突起，形成凋亡小體。另一種為自噬體形成方式：凋亡細胞內線粒體、內質網等和一些細胞內的胞質成分一起被內質網膜包裹，再與細胞膜融合后，形成凋亡小體。

③ 凋亡小體的消化。凋亡小體形成后，被巨噬細胞或者鄰近的細胞吞噬消化，此過程不影響細胞的其他生理功能，也不引起周圍細胞的炎癥反應。

1.2 細胞凋亡的過程

細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化→進入連續反應過程。

細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應的信號刺激后胞內一系列控制開關的開啟或關閉。不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉導也不相同，客觀上說現在對細胞凋亡過程中信號傳遞系統的認識還是不全面的，其過程非常復雜，比較清楚的通路主要有：

（1） 細胞凋亡的膜受體通路：各種外界因素是細胞凋亡的啟動劑，它們可以通過不同的信號傳遞系統傳遞凋亡信號，引起細胞凋亡。以Fas-FasL為例：

Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，與FasL結合可以啟動凋亡信號的轉導引起細胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導受體三聚體化，然后在細胞膜上形成凋亡誘導復合物。這個復合物中包括帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADD。Fas一旦和配體FasL結合，可通過Fas分子啟動致死性信號轉導，最終引起細胞一系列特征性變化，使細胞死亡。

Fas分子胞內段帶有特殊的死亡結構域（death domain，DD）。三聚化的Fas和FasL結合后，使三個Fas分子的死亡結構域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結構域的蛋白FADD。FADD是死亡信號轉錄中的一個連接蛋白，由兩部分組成：C端（DD結構域）和N端（DED）部分。DD結構域負責和Fas分子胞內段上的DD結構域結合，該蛋白再以DED連接另一個帶有DED的后續成分，由此引起N段DED隨即與無活性的Caspase-8酶原發生同嗜性交聯，聚合多個Caspase-8的分子，Caspase-8分子遂由單鏈酶原轉成有活性的雙鏈蛋白，進而引起隨后的級聯反應，后者作為酶原而被激活，引起下面的級聯反應，細胞發生凋亡。

（2） 細胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學途徑：線粒體不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調控中心。實驗表明了細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子1（Apaf-1）結合，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結合形成凋亡小體，Caspase-9被激活，被激活的Caspase-9能激活其他的Caspase如Caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。此外，線粒體還釋放凋亡誘導因子如AIF，參與激活caspase。促凋亡因子能誘導細胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細胞色素C從線粒體釋放的調節是細胞凋亡分子機理研究的關鍵問題。

盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經確定Caspase在凋亡過程中是起著必不可少的作用。細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程。到目前為止，至少已有14種Caspase被發現，Caspase分子間的同源性很高，結構相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。根據功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二類參與細胞凋亡，包括Caspase2、3、6、7、8、9、10。

1.3 細胞自噬

細胞自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，參與了多種疾病的發生和發展。自噬在古希臘語中是“自食”。它是一種保守的細胞自我降解方式，是將受損細胞器及大分子物質通過溶酶體降解再利用的過程。基礎水平的自噬是維持細胞穩態所必需的，同時自噬參與抗衰老、分化及發育、免疫及清除微生物、腫瘤等疾病的病理生理過程。根據結合分子的方式，自噬分為巨自噬、微小自噬和伴侶分子介導的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。

自噬是一系列自噬體結構演變的過程，由自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）執行精細的調控。在饑餓、低氧、藥物等因素作用下，待降解的細胞成分周圍會形成雙層結構分隔膜，隨后分隔膜逐漸延伸，最終將待降解的胞漿成分完全封閉形成自噬體；自噬體形成后將通過細胞骨架微管系統運輸至溶酶體，二者融合形成自噬溶酶體；最終其內容物在溶酶體酶作用下被細胞降解利用。

自噬對細胞死亡的調節具有雙重性：溫和的自噬一定程度上保護細胞免受有害條件的侵害，促進細胞存活；嚴重或快速的自噬將誘導細胞程序性死亡，被稱為自噬性細胞死亡（autophagy-mediated cell death，ACD）。

1.4 細胞凋亡的生理意義

細胞凋亡能確保個體正常發育、生長，根據代謝需要調節細胞數量、保持成體器官正常體積。如：指（趾）間隙的形成；細胞凋亡與胚胎發育、組織發生、組織分化和修復等過程有緊密的聯系。為適應發育或組織更新的需要，機體中的細胞會在某些特定的時刻發生凋亡。如：在皮膚外層細胞的形成過程中，皮膚細胞生成于皮膚深層，然后慢慢向外表面遷移，遷移途中有些會發生凋亡，凋亡細胞就會形成具有保護作用的皮膚角質層。又如，人的唯一透明組織——眼球晶狀體的發育，在胎兒形成早期階段，由干細胞發育來的晶狀體細胞與其他所有細胞一樣都含有細胞器，但隨著發育和分化的進展，晶狀體細胞發生特殊形式的凋亡，胞質中的細胞核和細胞器被毀壞，只保留完整的細胞膜，細胞膜內包裹著極濃稠的“晶狀體蛋白質”溶液，成為成熟的晶狀體。

此外，在成年階段，細胞凋亡也是機體清除體內多余的、受損的、癌變的或被微生物感染的細胞的重要手段。如T淋巴細胞在胸腺成熟過程中，約有95%以上不成熟的細胞發生凋亡，只有不到5%的細胞分化為成熟的T淋巴細胞進入外周血，并發揮其免疫學功能。

2 細胞焦亡

細胞焦亡是另一種程序性細胞死亡方式，2001年，華盛頓大學學者Cookson等首次使用“Pyroptosis”來形容在巨噬細胞中發現Caspase-1依賴的細胞死亡方式。其特征為依賴于caspase-1、caspase-4/5（人）、caspase-11（鼠）也可誘導細胞焦亡，還會出現大量促炎癥因子的釋放。細胞焦亡的形態學特征、發生及調控機制等均不同于凋亡、壞死等其他細胞死亡方式。細胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經系統相關疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發生發展。

2.1 細胞焦亡的形態學特征

研究表明，焦亡細胞在形態上同時具有凋亡和壞死的特征。與凋亡的形態學相似，焦亡細胞表現為細胞核濃縮，染色質DNA斷裂以及TUNEL染色陽性。但與凋亡不同，細胞焦亡細胞膜完整性喪失后細胞內容物釋放，誘發炎癥反應。研究表明細胞發生焦亡時細胞膜有1～2 nm的小孔形成，正是這些小孔使細胞內的離子平衡喪失，水分內流，細胞腫脹繼而膜破裂，細胞發生滲透性溶解。與細胞壞死的形態學也相似，表現為出現核碎裂、核溶解；細胞膜滲透性增高，細胞腫脹、破裂；胞質及內容物外泄，引起炎癥反應。

2.2 細胞焦亡的分子機制

細胞焦亡的主要分子機制：細胞焦亡是依賴于Caspase-1的細胞死亡方式，Caspase-1由一個被稱為炎癥小體的復合物在感知病原信號后激活，經典的炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、NAIP-NLRC4、AIM2和Pyrin等，是多蛋白信號復合物，每個炎癥小體包括1個Caspase激活和募集域（CARD）或PYD結構域。經典炎癥小體在激活Caspase-1后，將無活性的IL-1β前體和IL-18前體裂解為有活性的IL-1β和IL-18，進一步誘導其它炎癥細胞因子、趨化因子、粘附分子的合成，放大局部和全身炎癥反應。老鼠和人的巨噬細胞和樹突狀細胞是Caspase-1依賴的細胞焦亡的主要細胞類型。另外，Caspase-11還能通過非經典炎癥小體途徑活化，導致細胞焦亡。脂多糖（LPS）能直接與Caspase11的CARD結合并激活，然后調控NLRP3炎癥小體依賴的Caspase-1裂解，但目前這種細胞內脂多糖相關的作用機制還不清楚。同時，Caspase-4/5作為人類Caspase-11的相似物，能直接與脂多糖結合，激活與Caspase-11類似的細胞焦亡過程。

細胞程序性死亡（PCD）是個體生長發育及維持組織穩態的必要組成部分，細胞焦亡和細胞凋亡都屬于細胞程序性死亡。細胞焦亡由inflammasomes激活的Caspase-1觸發。Caspase-1激活可誘導IL-1β和IL-18分泌，細胞焦亡導致細胞溶解、胞質內容物釋放到細胞外，引起炎癥反應。作為一種伴隨炎癥反應的細胞死亡方式，細胞焦亡的意義并不亞于凋亡，在某些病理過程中，細胞焦亡甚至比凋亡更具實際意義。目前，較之于凋亡這一迄今為止研究最為深入的細胞死亡方式，隨著對細胞焦亡的認識和研究剛剛起步，無論是在細胞焦亡的發生機制與調控機制，還是在細胞焦亡的檢測技術方面都將需要更多更細致的研究。

參考文獻：

[1] 翟中和，王喜忠，丁明孝著.細胞生物學[M].北京：高等教育出版社，2011，454.

[2] 劉海峰，孫文匯，高洪等.細胞凋亡的特征及其檢測方法[J].動物醫學進展，2008，29（3）：106.

[3] Ryter SW， Mizumura K， Choi AM. The impact of autophagy on cell death modalities[J]. Int J Cell Biol， 2014，2014： 502-676.

[4] 祁會麗，姚麗芬.細胞焦亡激活機制及相關疾病研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志，2016，12（5）：7-9.

[6] Duprez L，Wirawan E， BergheTV，et a1.Major cell death path—ways at a glance[J].Microbes and Infection，2009.1l：1050-1062.

[7] J Shi，Y Zhao，K Wang，X Shi，Y Wang.Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death[J]. Nature， 2015，526（7575）：660-665.

[8] 林靜，李大主.細胞焦亡：一種新的細胞死亡方式[J].國際免疫學雜志，2011，34（3）：213-216.