2016年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)背景下的細(xì)胞死亡方式再認(rèn)識(shí)

鄧過房

摘 要 細(xì)胞死亡是生物界普遍存在的現(xiàn)象，細(xì)胞死亡的方式多種多樣，重點(diǎn)介紹細(xì)胞程序性死亡（PCD）中的兩種細(xì)胞死亡方式：細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞焦亡

中圖分類號(hào) Q-49 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 E

2016年10月3日北京時(shí)間17：30，諾貝爾基金會(huì)宣布將2016年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予大隅良典教授，以表彰他在自噬反應(yīng)領(lǐng)域做出的卓越貢獻(xiàn)。自噬反應(yīng)屬于Ⅱ型細(xì)胞凋亡類型。細(xì)胞死亡是生物界普遍存在的現(xiàn)象，不同于機(jī)體死亡。正常組織中，每天都有千千萬萬個(gè)細(xì)胞死亡，生物體主要通過嚴(yán)格控制細(xì)胞死亡和細(xì)胞增殖之間的平衡來調(diào)控細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量。細(xì)胞死亡的方式通常有2種：細(xì)胞壞死、細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。基于機(jī)制可以將程序性細(xì)胞死亡分為兩大類：Caspase（半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶）依賴的和Caspase非依賴的，前者包括典型的細(xì)胞凋亡和新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞焦亡。下面重點(diǎn)介紹“細(xì)胞凋亡與細(xì)胞焦亡”這兩種細(xì)胞死亡方式。

1 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡一詞最早是由英國的病理學(xué)家科爾和希臘語教授馬克于1972年提出的。在希臘語中，apo的意思是脫離，ptosis的意思為落下，將這兩個(gè)詞組合（apoptosis）用來描述與秋葉落下和花兒凋謝類似的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。到1990年，細(xì)胞凋亡的研究獲得了里程碑式的重大進(jìn)展，證明了細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的主動(dòng)過程，典型的細(xì)胞凋亡過程涉及一系列Capase的水解、活化和信號(hào)傳遞過程。

1.1 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征

細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間的連接消失，同時(shí)細(xì)胞間的密度增加，核質(zhì)濃縮成一個(gè)或幾個(gè)大的包團(tuán)，染色質(zhì)遷移至核膜周邊形成新月形凝集，細(xì)胞核裂解為碎塊，進(jìn)而細(xì)胞膜內(nèi)陷自行分割成幾個(gè)由細(xì)胞膜包裹的，表面光滑的凋亡小體；DNA被特異性的核酸內(nèi)切酶分解成180～220 bp的片斷，瓊脂糖電泳出現(xiàn)特征性的DNA梯狀區(qū)帶，在細(xì)胞凋亡早期需要大量的ATP。

根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，可將細(xì)胞凋亡分為3個(gè)階段：

① 凋亡開始。細(xì)胞表面的微絨毛、細(xì)胞突起及細(xì)胞表面的褶皺等特化結(jié)構(gòu)消失，但細(xì)胞膜依然完整，沒有失去選擇通透性；線粒體大體保持完整，但偶爾也見到線粒體變大，嵴增多；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹擴(kuò)大；細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)有時(shí)變得致密和紊亂；染色質(zhì)濃縮，分布在核膜周圍或一側(cè)，呈眼球狀。

② 凋亡小體的形成。凋亡小體的產(chǎn)生有兩種方式。一種為發(fā)芽脫落方式：首先染色體斷裂為大小不等的片斷，然后通過發(fā)芽起泡，與一些細(xì)胞器聚集在一起，形成一球形的突起，形成凋亡小體。另一種為自噬體形成方式：凋亡細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等和一些細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)成分一起被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包裹，再與細(xì)胞膜融合后，形成凋亡小體。

③ 凋亡小體的消化。凋亡小體形成后，被巨噬細(xì)胞或者鄰近的細(xì)胞吞噬消化，此過程不影響細(xì)胞的其他生理功能，也不引起周圍細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

1.2 細(xì)胞凋亡的過程

細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個(gè)階段：接受凋亡信號(hào)→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程。

細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉。不同的外界因素啟動(dòng)凋亡的方式不同，所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同，客觀上說現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞凋亡過程中信號(hào)傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還是不全面的，其過程非常復(fù)雜，比較清楚的通路主要有：

（1） 細(xì)胞凋亡的膜受體通路：各種外界因素是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)劑，它們可以通過不同的信號(hào)傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號(hào)，引起細(xì)胞凋亡。以Fas-FasL為例：

Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，與FasL結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導(dǎo)受體三聚體化，然后在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物中包括帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD。Fas一旦和配體FasL結(jié)合，可通過Fas分子啟動(dòng)致死性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起細(xì)胞一系列特征性變化，使細(xì)胞死亡。

Fas分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）。三聚化的Fas和FasL結(jié)合后，使三個(gè)Fas分子的死亡結(jié)構(gòu)域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白FADD。FADD是死亡信號(hào)轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)連接蛋白，由兩部分組成：C端（DD結(jié)構(gòu)域）和N端（DED）部分。DD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)和Fas分子胞內(nèi)段上的DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該蛋白再以DED連接另一個(gè)帶有DED的后續(xù)成分，由此引起N段DED隨即與無活性的Caspase-8酶原發(fā)生同嗜性交聯(lián)，聚合多個(gè)Caspase-8的分子，Caspase-8分子遂由單鏈酶原轉(zhuǎn)成有活性的雙鏈蛋白，進(jìn)而引起隨后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，后者作為酶原而被激活，引起下面的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞發(fā)生凋亡。

（2） 細(xì)胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學(xué)途徑：線粒體不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。實(shí)驗(yàn)表明了細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1（Apaf-1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，Caspase-9被激活，被激活的Caspase-9能激活其他的Caspase如Caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還釋放凋亡誘導(dǎo)因子如AIF，參與激活caspase。促凋亡因子能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細(xì)胞色素C從線粒體釋放的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究的關(guān)鍵問題。

盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase在凋亡過程中是起著必不可少的作用。細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程。到目前為止，至少已有14種Caspase被發(fā)現(xiàn)，Caspase分子間的同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。根據(jù)功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細(xì)胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二類參與細(xì)胞凋亡，包括Caspase2、3、6、7、8、9、10。

1.3 細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。自噬在古希臘語中是“自食”。它是一種保守的細(xì)胞自我降解方式，是將受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)通過溶酶體降解再利用的過程。基礎(chǔ)水平的自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的，同時(shí)自噬參與抗衰老、分化及發(fā)育、免疫及清除微生物、腫瘤等疾病的病理生理過程。根據(jù)結(jié)合分子的方式，自噬分為巨自噬、微小自噬和伴侶分子介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。

自噬是一系列自噬體結(jié)構(gòu)演變的過程，由自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）執(zhí)行精細(xì)的調(diào)控。在饑餓、低氧、藥物等因素作用下，待降解的細(xì)胞成分周圍會(huì)形成雙層結(jié)構(gòu)分隔膜，隨后分隔膜逐漸延伸，最終將待降解的胞漿成分完全封閉形成自噬體；自噬體形成后將通過細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體，二者融合形成自噬溶酶體；最終其內(nèi)容物在溶酶體酶作用下被細(xì)胞降解利用。

自噬對(duì)細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)具有雙重性：溫和的自噬一定程度上保護(hù)細(xì)胞免受有害條件的侵害，促進(jìn)細(xì)胞存活；嚴(yán)重或快速的自噬將誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，被稱為自噬性細(xì)胞死亡（autophagy-mediated cell death，ACD）。

1.4 細(xì)胞凋亡的生理意義

細(xì)胞凋亡能確保個(gè)體正常發(fā)育、生長，根據(jù)代謝需要調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、保持成體器官正常體積。如：指（趾）間隙的形成；細(xì)胞凋亡與胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、組織分化和修復(fù)等過程有緊密的聯(lián)系。為適應(yīng)發(fā)育或組織更新的需要，機(jī)體中的細(xì)胞會(huì)在某些特定的時(shí)刻發(fā)生凋亡。如：在皮膚外層細(xì)胞的形成過程中，皮膚細(xì)胞生成于皮膚深層，然后慢慢向外表面遷移，遷移途中有些會(huì)發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞就會(huì)形成具有保護(hù)作用的皮膚角質(zhì)層。又如，人的唯一透明組織——眼球晶狀體的發(fā)育，在胎兒形成早期階段，由干細(xì)胞發(fā)育來的晶狀體細(xì)胞與其他所有細(xì)胞一樣都含有細(xì)胞器，但隨著發(fā)育和分化的進(jìn)展，晶狀體細(xì)胞發(fā)生特殊形式的凋亡，胞質(zhì)中的細(xì)胞核和細(xì)胞器被毀壞，只保留完整的細(xì)胞膜，細(xì)胞膜內(nèi)包裹著極濃稠的“晶狀體蛋白質(zhì)”溶液，成為成熟的晶狀體。

此外，在成年階段，細(xì)胞凋亡也是機(jī)體清除體內(nèi)多余的、受損的、癌變的或被微生物感染的細(xì)胞的重要手段。如T淋巴細(xì)胞在胸腺成熟過程中，約有95%以上不成熟的細(xì)胞發(fā)生凋亡，只有不到5%的細(xì)胞分化為成熟的T淋巴細(xì)胞進(jìn)入外周血，并發(fā)揮其免疫學(xué)功能。

2 細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡是另一種程序性細(xì)胞死亡方式，2001年，華盛頓大學(xué)學(xué)者Cookson等首次使用“Pyroptosis”來形容在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Caspase-1依賴的細(xì)胞死亡方式。其特征為依賴于caspase-1、caspase-4/5（人）、caspase-11（鼠）也可誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，還會(huì)出現(xiàn)大量促炎癥因子的釋放。細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征、發(fā)生及調(diào)控機(jī)制等均不同于凋亡、壞死等其他細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展。

2.1 細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征

研究表明，焦亡細(xì)胞在形態(tài)上同時(shí)具有凋亡和壞死的特征。與凋亡的形態(tài)學(xué)相似，焦亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)DNA斷裂以及TUNEL染色陽性。但與凋亡不同，細(xì)胞焦亡細(xì)胞膜完整性喪失后細(xì)胞內(nèi)容物釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。研究表明細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)細(xì)胞膜有1～2 nm的小孔形成，正是這些小孔使細(xì)胞內(nèi)的離子平衡喪失，水分內(nèi)流，細(xì)胞腫脹繼而膜破裂，細(xì)胞發(fā)生滲透性溶解。與細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)也相似，表現(xiàn)為出現(xiàn)核碎裂、核溶解；細(xì)胞膜滲透性增高，細(xì)胞腫脹、破裂；胞質(zhì)及內(nèi)容物外泄，引起炎癥反應(yīng)。

2.2 細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制

細(xì)胞焦亡的主要分子機(jī)制：細(xì)胞焦亡是依賴于Caspase-1的細(xì)胞死亡方式，Caspase-1由一個(gè)被稱為炎癥小體的復(fù)合物在感知病原信號(hào)后激活，經(jīng)典的炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、NAIP-NLRC4、AIM2和Pyrin等，是多蛋白信號(hào)復(fù)合物，每個(gè)炎癥小體包括1個(gè)Caspase激活和募集域（CARD）或PYD結(jié)構(gòu)域。經(jīng)典炎癥小體在激活Caspase-1后，將無活性的IL-1β前體和IL-18前體裂解為有活性的IL-1β和IL-18，進(jìn)一步誘導(dǎo)其它炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子的合成，放大局部和全身炎癥反應(yīng)。老鼠和人的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡的主要細(xì)胞類型。另外，Caspase-11還能通過非經(jīng)典炎癥小體途徑活化，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。脂多糖（LPS）能直接與Caspase11的CARD結(jié)合并激活，然后調(diào)控NLRP3炎癥小體依賴的Caspase-1裂解，但目前這種細(xì)胞內(nèi)脂多糖相關(guān)的作用機(jī)制還不清楚。同時(shí)，Caspase-4/5作為人類Caspase-11的相似物，能直接與脂多糖結(jié)合，激活與Caspase-11類似的細(xì)胞焦亡過程。

細(xì)胞程序性死亡（PCD）是個(gè)體生長發(fā)育及維持組織穩(wěn)態(tài)的必要組成部分，細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡都屬于細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞焦亡由inflammasomes激活的Caspase-1觸發(fā)。Caspase-1激活可誘導(dǎo)IL-1β和IL-18分泌，細(xì)胞焦亡導(dǎo)致細(xì)胞溶解、胞質(zhì)內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，引起炎癥反應(yīng)。作為一種伴隨炎癥反應(yīng)的細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞焦亡的意義并不亞于凋亡，在某些病理過程中，細(xì)胞焦亡甚至比凋亡更具實(shí)際意義。目前，較之于凋亡這一迄今為止研究最為深入的細(xì)胞死亡方式，隨著對(duì)細(xì)胞焦亡的認(rèn)識(shí)和研究剛剛起步，無論是在細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制與調(diào)控機(jī)制，還是在細(xì)胞焦亡的檢測技術(shù)方面都將需要更多更細(xì)致的研究。

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