禽白血病病毒gp27基因的克隆測序及禽蛋檢測

曹俊俊+姜旭+孫珊珊+胡欣+宋建臣

（延邊大學動物醫學系）

摘 要：以RT-PCR方法從雞胚成纖維細胞（CEF）培養物中擴增出gp27片段，將RT-PCR產物重組到質粒栽體pUC19中，并對重組質粒進行酶切分析及序列測定。對市場銷售的雞蛋進行了gp27抗原檢測。結果表明，克隆片段720bp為完整目的基因，與國外分離株同源性達97.4%，市售雞蛋gp27抗原檢出率7%。

關鍵詞：禽白血病病毒；gp27基因；克隆測序

禽白血病（Aian Leukosis）是由反轉錄病毒科的禽白血病病毒（Aian Leukosis Virus， ALV）和肉瘤病病毒（Avian Sarcoma Virus， ASV）群中的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統稱。本病在世界各地均有發生，是危害養禽業的主要疾病之一[1]。P27是病毒的主要核心蛋白，分子量為27ku，為主要的群特異性抗原。在禽白血病/肉瘤病毒的檢測試驗中，均以p27作為抗原制備群特異性抗體，從而建立相應的病毒檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒及質粒

SR-RSV（Schmidt-Ruppin）株，克隆載體質粒pUC19 由本實驗室保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒、M-MLV反轉錄酶購自美國Gibco BRI公司；UNIQ-5柱離心式DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程有限公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶等購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank收錄的RSV核苷酸序列，用計算機輔助設計軟件Oligo設計了1對引物P1、P2，兩引物間的跨幅為720 bp，上游引物（P1：5' -CCCGTGGAATTCATGGCTGTAGTGATTAAG-3'）設計有Eco R I 酶切位點和起始密碼子ATG，下游引物（P2：5' -CATACTCGAGGGCTGGATAGCAGACTACAT-3'）設計有Xho I酶切位點和終止密碼子。引物由北京六合華大基因有限公司合成。

1.4 核酸提取

將SR-RSV接種于雞胚成纖維細胞（CEF）上，8 d后收毒，用RNA提取試劑盒（按操作說明書進行）提取核酸。

1.5 RT-PCR擴增gp27基因

RT反應在20？滋L體系中進行。取上述提取核酸2？滋L作為模板，加10 pmol/？滋L引物P11？滋L，90℃10min，立即冰浴5min，加入40U/？滋L核糖核酸酶抑制劑0.5？滋L，dNTP（各2.5mmol/L）2？滋L，5×反轉錄緩沖液（first strand buffer）4？滋L，200U/？滋L M-Mulv 1？滋L，加DEPC處理的雙蒸水至20？滋L，混勻，37℃45min，95℃5min滅活反轉錄酶。以上述反轉錄產物為模板的PCR反應在50？滋L體系中進行。反應條件為94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 2min，循環擴增25次，最后72℃延伸10min。擴增產物于含EB的8g/L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.6 PCR產物的定向克隆

按UNIQ-5柱離心式DNA膠回收試劑盒使用說明回收 Klenow 酶處理的PCR產物和Sma I酶切處理的pUC19質粒，用T4 DNA連接酶連接后轉化于感受態宿主菌，用藍自斑法篩選重組質粒。

1.7 重組質粒的PCR和酶切鑒定

按1.6的反應條件進行PCR反應，反應產物于8g/L瓊脂糖凝膠中電泳。用Eco R I、Xho I 進行酶切鑒定。

1.8 重組質粒的序列測定與分析

DNA序列由大連寶生物工程有限公司測定，借助于核苷酸序列分析軟件進行分析.并與GenBank中的相關毒株RSV J02342株進行比較。

2 結果

2.1 PCR反應

從接毒雛雞翅膀腫塊和接毒CEF培養物中擴增出的PCR產物，經8 g/L瓊脂糖凝膠電泳得到與預期結果相符的720bp的片段（見圖1）。

2.2 重組質粒的PCR鑒定與酶切鑒定

重組質粒的PCR產物經8g/L瓊脂糖凝膠電泳，得到與預期結果相符的720 bp的片段。重組質粒經Pvu Ⅱ酶切得到與預期結果相符的片段（見圖2）。

2.3 重組質粒的序列測定及分析

對構建的重組質粒進行序列測定及分析，并與已經發表的RSV J02342株核苷酸序列進行比較，同源性達97.7%，表明克隆的片段為gp27基因。

2.4 市售雞蛋的gp27抗原檢測

在本市不同超市隨機購買了240枚雞蛋，利用本實驗的方法對雞蛋蛋清進行了gp27檢測。結果表明，市售雞蛋gp27抗原檢出率7%。

3 討論

禽白血病是世界性分布的歷史悠久而又不斷出現新型病例的禽類病毒性可傳染的腫瘤性疾病，是嚴重危害養禽業發展的最重要疫病之一。由于病毒亞群個毒株的多樣性、相關內源性病毒存在的廣泛性，以及傳播途徑和發病情況的復雜性，使本病很難根除。其危害性不僅是引起病禽（主要是雞，特別是肉種雞）的死亡和淘汰，而且引起雞群生產能力的普遍降低，也影響蛋（胚）源或雞源細胞的醫學研究和生物制品的發展。1997年以來J亞群禽白血病在世界范圍內爆發，給養禽業造成了巨大的經濟損失。禽白血病病毒的主要蛋白質組分有gag基因編碼的核心蛋白，pol基因編碼的3種酶，env基因編碼的兩種糖蛋白。在gag編碼的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特異性抗原，他的保守性高，在病毒中的含量高，是制備檢測抗體的首選抗原。

RSV核心蛋白gp27基因是其主要的免疫原基因，具有RSV和ALV群特異性，以RSV gp27為抗原建立的免疫瓊脂擴散試驗及酶聯免疫吸附試驗等檢測方法，其特異性及靈敏性與完整病毒粒子抗原相同。目前適用于大規模流行病學調查和凈化的檢測方法主要還是針對ALV保守抗原P27的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。

至今人類對禽白血病的防治還無計可施，既沒有疫苗可以利用，也沒有有效的藥物治療，控制禽白血病的主要方法是通過病原檢測，淘汰陽性雞，從而凈化種群。目前國際金標準的最優凈化方案是，對核心雞群全部采血，接種DF-1細胞進行外源性ALV的分離鑒定，淘汰全部陽性雞進行種雞群凈化。

參考文獻

[1]B W.卡爾尼克（高福，等譯）.禽病學[M].第十一版，北京：中國農業大學出版社，2005，529.

[2]殷震，劉景華.動物病毒學[M].第二版.北京：科學出版社，1997.874-884.

[3]Calnek B W. Lesions in Young Chickens Induced by Lymphoid Leucosis Virus [J]. Avian Diseases，1968，12：111-129.

[4]Sandelin K， Estola T. Occurrence of Different Subgroups of Avian Leucosis Virus in Finnish Poultry[J].Avian Pathol，1974，3：159-168.

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通訊作者：宋建臣，副教授。