SOX4抑制凋亡介導(dǎo)食管癌順鉑耐藥的實驗研究*

符立平， 顧春榮， 熊佳時， 孫元玨， 吳敬波

201499上海，上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院 腫瘤科(符立平 ，顧春榮，熊佳時，孫元玨)；646000四川 瀘州，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科(吳敬波)

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?基礎(chǔ)研究?

SOX4抑制凋亡介導(dǎo)食管癌順鉑耐藥的實驗研究*

符立平， 顧春榮， 熊佳時， 孫元玨， 吳敬波△

201499上海，上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院 腫瘤科(符立平 ，顧春榮，熊佳時，孫元玨)；646000四川 瀘州，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科(吳敬波)

目的：探討SOX4與食管癌順鉑耐藥的關(guān)系及其耐藥機制。方法：采用遞增藥物濃度、間歇沖擊作用的方法構(gòu)建順鉑食管癌耐藥細(xì)胞株KYSE30/DDP；流式細(xì)胞儀檢測KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測SOX4及凋亡相關(guān)指標(biāo)在KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞中的變化；CCK8檢測干擾SOX4對KYSE30和KYSE30/DDP細(xì)胞順鉑敏感度的影響；流式細(xì)胞儀及Western blot檢測干擾SOX4對KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡及相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建了生長狀態(tài)良好的KYSE30/DDP細(xì)胞株，其耐藥指數(shù)為4.1；KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡較其親本細(xì)胞KYSE30明顯降低(t=-8.414,P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，SOX4在順鉑耐藥細(xì)胞KYSE30/DDP中的表達(dá)高于其親本細(xì)胞KYSE30，KYSE30/DDP細(xì)胞中凋亡相關(guān)指標(biāo)Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表達(dá)低于KYSE30；在KYSE30/DDP細(xì)胞中干擾SOX4，其對順鉑的敏感性及凋亡細(xì)胞增加(F=625.423,P<0.05)，凋亡相關(guān)指標(biāo)Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表達(dá)增加。結(jié)論：SOX4在食管癌順鉑耐藥細(xì)胞KYSE30/DDP中高表達(dá)，并可通過抑制凋亡介導(dǎo)食管癌順鉑耐藥。

食管癌; 順鉑; SOX4; 耐藥

食管癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在我國所有惡性腫瘤中分別位居第5和第6位。[1]由于其早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已屬于中晚期，失去手術(shù)治療時機。盡管食管癌治療的手段不斷改進(jìn)，但晚期患者5年生存率仍不足10%[2]，治療失敗的原因主要是局部病灶控制不佳和復(fù)發(fā)[3]。放化療是食管癌輔助治療的重要手段，而腫瘤細(xì)胞對化療藥物原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥是導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的的重要原因之一。順鉑(DDP)是晚期食管癌化療常用藥物，但耐藥常導(dǎo)致化療失敗。因此闡明食管癌耐藥的具體分子機制,尋找新的化療耐藥預(yù)測靶點，對指導(dǎo)臨床治療及延長患者存活時間至關(guān)重要。近年來的研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子SOX4在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中扮演著重要角色，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制凋亡等[4-5]。同時有文獻(xiàn)報道其在口腔鱗狀細(xì)胞癌中與化療抵抗相關(guān)[6]，而SOX4在食管癌中與化療耐藥暫未見報道。因此本研究主要探討SOX4與食管癌化療抵抗的關(guān)系及相關(guān)分子機制，以期為食管癌靶向治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食管癌細(xì)胞KYSE30購自中科院上海細(xì)胞庫，順鉑注射液為江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，RPMI-1640及胎牛血清均為GIBCO公司產(chǎn)品，CCK8試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為南京凱基公司產(chǎn)品，SOX4、Caspase-3、Cleaved caspase-3及Cleaved PARP抗體均為Abcam公司產(chǎn)品。SOX4干擾序列購于上海吉瑪基因，干擾靶序列分別為siRNA1 5′-AAGACGACCTGCTCGACCTGA-3′，siRNA2 5′-AACTCCAAACCGGCGCAGAAA-3′,siRNA3 5′-AAGAAGGTGAAGTCCGGCAAC-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

KYSE30細(xì)胞采用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，置于 37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗。

1.3 耐藥細(xì)胞的構(gòu)建

采用遞增藥物濃度、間歇沖擊作用的方法構(gòu)建耐藥細(xì)胞株[7]。取狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的KYSE30細(xì)胞，從濃度為0.5μM的DDP開始培養(yǎng)，24h后更換為正常培養(yǎng)基，觀察到細(xì)胞恢復(fù)正常生長，再次用初始濃度的DDP培養(yǎng)基培養(yǎng)KYSE30細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞死亡后換為正常培養(yǎng)基，細(xì)胞穩(wěn)定生長并傳代3次，測定IC50。隨后提高DDP濃度反復(fù)作用直至細(xì)胞能在10μMmDDP的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)并連續(xù)傳代3次，最后測KYSE30的DDP耐藥細(xì)胞株IC50為20.9，命名為KYSE30/DDP，此過程持續(xù)180天。

1.4 CCK8法測定細(xì)胞對DDP的敏感度

將細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于96孔板，24h后將不同濃度的順鉑加入對應(yīng)培養(yǎng)孔，每種濃度設(shè)5個平行復(fù)孔。培養(yǎng)24h后棄上清，加入含10%體積分?jǐn)?shù)的CCK-8完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2h后在酶標(biāo)儀上檢測各孔450nm波長的吸光度值。細(xì)胞抑制率=(1 -加藥孔吸光度值/對照孔吸光度值)×100%，所有實驗均重復(fù)3次統(tǒng)計IC50值。耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液冰上裂解40min，14 000r/min離心10min，收集上清用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積，20μg蛋白樣品在10% SDS-PAGE凝膠中電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃孵育過夜，TBST 5min/次搖床洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 5min/次搖床洗膜3次后ECL顯色。

1.6 RNA的提取

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。將待提取細(xì)胞按每106個細(xì)胞加1mL trizol，反復(fù)吹打至不粘稠后轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管中室溫靜置5min，每1mL trizol加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩混勻后室溫靜置10min，12 000r/min離心10min，吸取上清轉(zhuǎn)移到新的EP管，加入與上清等體積的異丙醇，室溫靜置5min，12 000r/min離心10min，棄上清后用75%酒精洗滌，12 000r/min離心5min，棄上清后室溫風(fēng)干5min，加20μL DEPC水吹打混勻后測濃度。

1.7 實時熒光定量PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCT)檢測SOX4的表達(dá)

嚴(yán)格按照Takara公司說明書進(jìn)行操作，采用PrimeScriptTM RTMaster Mix制備cDNA，按RNA 0.5μg，5×PrimeScript RT Master Mix 2μL，加 ddH2O 至總體積10μL后在37℃ 15 min，85℃ 5 s條件下反應(yīng)生成cDNA，產(chǎn)物加DEPC水稀釋 5 倍后用于RT- PCR。通過SYBR Green法進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參考 SYBR PremixExTaqTM II。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃延伸34s，共40個循環(huán)。

1.8 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用含10μg/mLDDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，隨后用不含EDTA的胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，2000rpm離心5min，收集1～5×105細(xì)胞，加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5μL的FITC標(biāo)記的AnnexinⅤ混勻后，加入5μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)5～15min，流失細(xì)胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗, 多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KYSE30/DDP耐藥細(xì)胞株的建立及耐藥測定

CCK8結(jié)果顯示，KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞經(jīng)不同順鉑藥物濃度處理后，IC50值分別為5.1和20.9，見圖1A、1B。KYSE30/DDP細(xì)胞同時也顯示出對5-FU、紫杉醇耐藥(RI分別為2.69和2.03，P<0.05，見表1)。

圖1 KYSE30耐藥及親代細(xì)胞對順鉑的敏感性及IC50比較(A.CCK8檢測KYSE30耐藥親代細(xì)胞對順鉑的敏感性,B.順鉑IC50比較)

表1 不同藥物在KYSE30及KYSE30/DDP中的IC50及耐藥指數(shù)

2.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，KYSE30/DDP細(xì)胞及KYSE親本細(xì)胞早期凋亡率分別為(6.533±0.351，11.300±0.917)，與親本細(xì)胞KYSE30相比，KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡明顯降低(t=-8.141,P<0.05)，見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡

2.3 SOX4在KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot及RT-PCR結(jié)果均顯示，SOX4在KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞中均有表達(dá)，順鉑耐藥細(xì)胞KYSE30/DDP中SOX4的表達(dá)高于其親本細(xì)胞KYSE30，見圖3。

圖3 Western blot及RT-PCR檢測SOX4在KYSE30耐藥細(xì)胞及親代細(xì)胞中的表達(dá)(A.Western blot檢測;B.SOX4蛋白表達(dá)相對變量;C.RT-PCR檢測mRNA表達(dá))

2.4 KYSE30及KYSE30/DDP細(xì)胞中凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化

Western blot結(jié)果顯示，KYSE30/DDP細(xì)胞中凋亡相關(guān)指標(biāo)Cleaved caspase-3及Cleaved PARP的表達(dá)低于其親本細(xì)胞KYSE30，見圖4。

圖4 Western blot檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)在KYSE30耐藥細(xì)胞及親代細(xì)胞中的表達(dá)

2.5 SOX4對KYSE30/DDP細(xì)胞順鉑敏感度的影響

RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示SOX4的干擾片段干擾均有效，其中siRNA-2干擾效率最高，選取siRNA-2干擾片段進(jìn)行后續(xù)實驗，見圖5A、5B。CCK8結(jié)果顯示，在KYSE30親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞中干擾掉SOX4，其對順鉑的敏感性增加(F=198.342,P<0.05)，在KYSE30/DDP耐藥細(xì)胞中干擾SOX4的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)其對順鉑的耐藥(F=625.423,P<0.05)，見圖5C、5D。

2.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測SOX4對KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，KYSE30/DDP細(xì)胞早期凋亡率為(5.167±0.321)，KYSE30/DDP細(xì)胞中干擾掉SOX4后其早期凋亡率為(7.333±0.513)，凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖6。

圖5 A、B分別為RT-PCR和Western blot檢測SOX4的干擾效率；C、D分別為CCK8檢測KYSE30親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中干擾SOX4后順鉑敏感性的變化

圖6 流式細(xì)胞儀檢測干擾SOX4后KYSE30/DDP細(xì)胞凋亡的變化

2.7 SOX4對KYSE30/DDP細(xì)胞中凋亡指標(biāo)的影響

Western blot結(jié)果顯示，在KYSE30/DDP細(xì)胞中干擾掉SOX4，Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表達(dá)增加，見圖7。

圖7 Western blot檢測在耐藥細(xì)胞KYSE30/DDP中干擾SOX4的表達(dá)對凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響

3 討 論

食管癌是全世界高發(fā)的惡性腫瘤之一，死亡率高居各種惡性腫瘤第6位，五年生存率不足10%。2012年，全球約有456 000新發(fā)病例和400 000死亡病例，嚴(yán)重威脅人類健康[8]。根據(jù)組織學(xué)分型，食管癌分為食管鱗癌和食管腺癌。在亞洲，食管癌以鱗狀細(xì)胞癌為主，而美國則以腺癌居多[8-9]。對于早期食管癌，手術(shù)治療是最佳選擇。但因食管癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期。順鉑是一種經(jīng)典的細(xì)胞毒性化療藥，被廣泛應(yīng)用于多種實體腫瘤的一線治療，包括睪丸癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、肺癌等[10]。在食管癌中，無論是術(shù)前的新輔助化療或者聯(lián)合放化療，順鉑均能顯著改善患者預(yù)后[11-12]。但是原發(fā)性或繼發(fā)性的化療抵抗，導(dǎo)致長期生存率不足25%[13]。因此闡明食管癌順鉑耐藥的機制，對解決化療抵抗瓶頸，延長患者預(yù)后具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子SOX4屬于SRY(sex-determining region Y)家族成員之一，因與高遷移族蛋白(high-mobility-group，HMG)保守區(qū)高度同源，命名為SOX(SRY-related high-mobility-group-box)亞族[14]。SOX4被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌[15-16]、前列腺癌[17-18]、結(jié)直腸癌[19-20]等。研究證實，SOX4是TGF-β的下游，TGF-β可通過SOX4以及其下游信號通路促進(jìn)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[16,19-20]。前列腺癌中，Bilir等發(fā)現(xiàn)SOX4參與多條腫瘤相關(guān)信號傳導(dǎo)，如PI3K/AKT通路，Wnt/β-catenin通路以及AR通路；同時，SOX4又是PTEN/PI3K/AKT/mOTR的下游，即SOX4形成信號通路相關(guān)正反饋回路，促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展[17]。無獨有偶，在食管癌中，SOX4與EZH2和HDAC3組成抑制復(fù)合物，結(jié)合到miR-31的啟動子區(qū)域，通過表觀遺傳學(xué)途徑抑制miR-31的表達(dá)。同時，SOX4本身又是miR-31的靶點，通過正反饋環(huán)路，促進(jìn)食管癌轉(zhuǎn)移[21]。除了參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，SOX4還參與其他多種惡性生物學(xué)行為，包括耐藥和凋亡。宮頸癌中，SOX4通過上調(diào)多重耐藥基因ABCG2的表達(dá)，降低CaSki細(xì)胞的順鉑化療敏感性[22]。口腔鱗狀細(xì)胞癌中，體外實驗證實SOX4的敲除增加HNSCC細(xì)胞對放療的敏感性和順鉑化療的敏感性。腫瘤耐藥的具體分子機制仍不清楚，文獻(xiàn)報道凋亡是腫瘤耐藥的常見機制之一。SOX4被證實也參與腫瘤的凋亡調(diào)控。Hur等報道在肝癌中，SOX4可抑制p53誘導(dǎo)的凋亡，是肝癌患者不良預(yù)后的有效分子標(biāo)志物[23]。在腺囊癌細(xì)胞ACC3中敲除SOX4的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡比例較對照組提高73%，證實SOX4可能是抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的關(guān)鍵因子[24]。然而，迄今為止尚無SOX4與食管癌順鉑耐藥的相關(guān)研究，其在順鉑耐藥中的作用與機制亟需進(jìn)一步探索。

本研究中，通過構(gòu)建順鉑耐藥株KYSE30/DDP，證實耐藥株KYSE30/DDP具有更低的順鉑化療敏感性和更高的抗凋亡能力，實驗發(fā)現(xiàn)較親代細(xì)胞KYSE30相比，SOX4在耐藥株中的表達(dá)顯著上調(diào)。通過siRNA特異性干擾SOX4內(nèi)源性表達(dá)，證實干擾SOX4可增加順鉑藥敏，并部分逆轉(zhuǎn)耐藥株的順鉑抗性。同時SOX4的干擾促進(jìn)凋亡指標(biāo)Cleaved caspase-3及Cleaved PARP的表達(dá)，說明SOX4介導(dǎo)順鉑耐藥的機制可能與其抗凋亡能力相關(guān)。通過本研究，明確了SOX4在食管癌順鉑耐藥中的關(guān)鍵作用，抑制食管癌細(xì)胞SOX4的表達(dá)有望成為解決化療抵抗、改善病人預(yù)后的新方向。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

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ExperimentalStudyofSOX4MediatedCisplatinResistanceinEsophagusCancerbyInhibitingApoptosis*

Fu Liping1, Gu Chunrong1, Xiong Jiashi1, Sun Yuanjue1, Wu Jingbo2△

(1.DepartmentofOncology，CentralHospitalofShanghaiFengxianDistrict,Shanghai201499,China;2.DepartmentofOncology，TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，Sichuan，China)

Objective: To explore the relationship between cisplatin resistance and the expression of SOX4, and related drug resistance mechanisms in esophagus cancer.Methods: The cisplatin resistance cell line KYSE30/DDP was established in culture by a program of treating KYSE30 parent cells in culture with increasing concentration of cisplatin. The apoptosis of KYSE30 and KYSE30/DDP cells were determined by flow cytometry. Western blot detected the expression of SOX4 and apoptosis related indicators in KYSE30 and KYSE30/DDP cells. The influence of drug sensitively by knockdown the expression of SOX4 in KYES30 and KYSE30/DDP cell was measured by CCK8 assay.The change of apoptosis and related indicators in KYSE30/DDP cell after knockdown the expression of SOX4 was evaluated by western blot and flow cytometry.Results: CCK8 assay showedthe cisplatin resistance cell line KYSE30/DDP was successfully built, and the resistance index was 4.1. The apoptosis of KYSE30/DDP cell was significantly decreased compared with KYSE30 parent cell(P<0.05). Western blot indicated the expression of SOX4 are higher in KYSE30/DDP cell compared to its parent cell. And the expression of apoptosis related indicators lower in KYSE30/DDP cell. Knock down the expression of SOX4 in KYSE30/DDP cellfacilitated thecisplatin sensitivity andpromoted cell apoptosis(P<0.05),with the increase expression of apoptosis related indicators .Conclusion: SOX4 was high-expression in cisplatin resistance cell KYSE30/DDP, and mediated cisplatin resistance by inhibiting apoptosis.

Esophagus Cancer；SOX4；Apoptosis；Cisplatin Resistance

2016- 11- 15 [

] 2017- 02- 20

*瀘州市政府-西南醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合項目(編號:2013LZLY-J40)

△吳敬波，E-mail:wjb6147@163.com

R735.1;R730.53

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.03.002

Fu LP, Gu CR, Xiong JS, et al. Experimental study of SOX4 mediated cisplatin resistance in esophagus cancer by inhibiting apoptosis[J]. J Cancer Control Treat, 2017,30(3):158-163 .[ 符立平 ，顧春榮，熊佳時,等. SOX4抑制凋亡介導(dǎo)食管癌順鉑耐藥的實驗研究 [J].腫瘤預(yù)防與治療，2017,30(3):158-163.]