壯藥清解霧化液質量標準研究

莫小林，伍小燕 ，龔敏陽，陳曉明，韋振源

（廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西南寧530023）

·檢驗檢測·

壯藥清解霧化液質量標準研究

莫小林，伍小燕 ，龔敏陽，陳曉明，韋振源

（廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西南寧530023）

目的建立清解霧化液的質量標準。方法采用薄層色譜法（TLC）對清解霧化液中的桑葉、一點紅、崗梅根進行定性鑒定。采用高效液相色譜（HPLC）法測定清解霧化液中蘆丁的含量，色譜柱為Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為甲醇－0.1%磷酸溶液（35∶65），檢測波長為356 nm，流速為1.0mL／min，柱溫為35℃。結果桑葉、一點紅、崗梅根薄層色譜斑點清晰，陰性對照無干擾；蘆丁質量濃度在2～20 g／mL范圍內與峰面積線性關系良好，r＝0.999 6，平均回收率為99.92%，RSD為0.99%（n＝6）。結論該方法操作簡單、專屬性和重復性良好，可作為該制劑的質量控制方法。

清解霧化液；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法；蘆丁

壯藥清解霧化液為廣西中醫藥大學第一附屬醫院在研醫療機構制劑，由醫院兒科李偉偉主任醫師于廣西壯鄉民間挖掘整理而成。全方由桑葉（壯語名Mbawsang）、千里光（壯語名Gogoujleixmingz）、崗梅根（壯語名Raggodiem jcaengh）、一點紅（壯語名Gemh onh）等壯藥材組方，具有疏風清熱、解毒利咽的功效[1]，用于治療兒童呼吸道感染性疾病，已有10多年的臨床應用經驗，并取得了一定的臨床療效，但目前尚無清解霧化液的質量標準。本研究小組欲將其申報為醫院制劑，為了確保其質量穩定性和臨床有效性，本研究中建立了桑葉、崗梅根、一點紅的薄層色譜（TLC）鑒別方法，同時建立了制劑中桑葉有效成分蘆丁的含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT型高效液相色譜儀，包括DGU－20A泵和SPD－20A型紫外檢測器(日本島津公司）；HCT－360型柱溫箱（天津市恒科技發展有限公司）；YOKOCS型紫外線透射反射成像儀（武漢藥科新技術開發有限公司）；GH－25型電子分析天平（精度為十萬分之一，德國Sartorius公司）；KQ3200DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CD－UPT－Ⅱ－10L型超純水制造系統（成都超純科技有限公司）；HHW型三用恒溫水箱（金壇市大自動儀器廠）；硅膠G（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

桑葉對照藥材（批號為121123－201305），一點紅對照藥材（批號為121359－200703）；崗梅根對照藥材（批號為121152－201103）；蘆丁對照品（批號為100080－201409），以上對照品和對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇和磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純；清解霧化液樣品（批號分別為20140403，20140713，20140726，廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑室）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[2]

2.1.1 桑葉

取本品40 mL，加甲醇50m L，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20m L，使溶解，加氯仿液30m L振搖，棄去氯仿液，水溶液用水飽和的正丁醇振搖，提取2次，每次20mL，合并正丁醇提取液，正丁醇提取液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取桑葉對照藥材2 g，加乙醇30 mL，回流提取2 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加水30 m L使溶解，用氯仿振搖，提取3次，每次30 m L，合并氯仿液，濾液蒸干，殘渣加甲醇1m L使溶解，作為對照藥材溶液。再取缺桑葉的陰性樣品40 mL，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法2015年版《中國藥典（一部)》附錄ⅥB試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿－甲醇（13∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下（365 nm）檢視。供試品溶液色譜中，在與桑葉對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾(圖1)。

1－3.供試品溶液4.桑葉對照藥材溶液5.陰性對照品溶液圖1桑葉薄層色譜鑒別圖

2.1.2 一點紅

取本品20 m L，加入乙醚20m L，超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加20 mL水使溶解，用氯仿提取2次，每次20 m L，合并氯仿液，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加1m L氯仿溶解，作為供試品溶液。稱取一點紅對照藥材5 g，加80%乙醇80mL，回流提取1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加20mL水使溶解；加入乙醚20m L，超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加20m L水溶解，用氯仿提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加1m L氯仿溶解，制成對照藥材溶液。另取處方中無一點紅的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述3種溶液各5μL，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與一點紅對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾(圖2)。

1－3.供試品溶液4.一點紅對照藥材溶液5.陰性對照品溶液圖2一點紅薄層色譜鑒別圖

2.1.3 崗梅根

取本品20mL，加乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上濃縮至1m L，作為供試品溶液。稱取崗梅根對照藥材5 g，加水60 mL，加熱回流提取2 h，過濾，濾液濃縮至20m L，加乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上濃縮至1mL，即得崗梅根對照藥材溶液。另取處方中無崗梅根的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述3種溶液各5μL，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－冰乙酸（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品溶液色譜中，在與崗梅根對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾(圖3)。

2.2 桑葉中蘆丁含量測定(高效液相色譜法)

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Discovery C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－0.1%磷酸溶液（35∶65）；檢測波長：356 nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL／min；進樣量：20μL。理論板數大于2 000。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取經120℃干燥至恒重的蘆丁對照品2.50mg，精密稱定，置25m L容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（0.100 0mg／m L）。

1－3.供試品溶液4.崗梅根對照藥材溶液5.陰性對照品溶液圖3崗梅根薄層色譜鑒別圖

供試品溶液：精密量取本品20mL，于水浴上蒸干，殘渣加50%甲醇20mL溶解，置50mL具塞錐形瓶中，稱定質量，超聲提取30min，冷卻至室溫，補足減失的質量，搖勻，濾過，轉移至25m L容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：精密量取缺桑葉的陰性對照品溶液20 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，供試品溶液與蘆丁對照品溶液色譜在相同保留時間處有色譜峰，陰性對照品溶液色譜在此保留時間處無色譜峰(圖4)，陰性無干擾，表明方法具有專屬性。

線性關系考察：精密吸取蘆丁對照品溶液（0.100 0 g／L）0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0 m L，分別置10 m L容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得2，3，4，5，10，20μg／mL 6個質量濃度的標準溶液。按擬訂色譜條件，分別進樣20μL，以峰面積(A)對質量濃度(C)進行回歸分析，得回歸方程A＝24 093C－10 173，r＝0.999 6 (n＝6)。結果表明，蘆丁質量濃度在2～20μg／m L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取蘆丁對照品溶液（0.100 0 g／L）重復進樣6次，測定峰面積。結果的RSD為0.90%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別置于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定。結果峰面積的RSD為2.25%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性較好。

A.對照品溶液B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖4高效液相色譜圖

重復性試驗：取同一批樣品，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果蘆丁的含量平均為15.49μg／mL，RSD為1.35%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為20140713）5 m L，各6份，分別精密加入蘆丁對照品溶液，加低、中、高濃度各3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定含量，計算回收率。結果見表1。

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進樣測定，計算樣品中蘆丁的含量。結果見表2。

3 討論

清解霧化液中的桑葉、崗梅根、一點紅、千里光為主產于廣西的道地藥材，資源廣泛，在廣西民間應用廣泛。其中桑葉可祛風毒、解痧毒、清熱毒，用于痧病、埃病（咳嗽）、蘭奔(眩暈)、火眼(急性結膜炎)[3]等；崗梅能解熱毒、通龍路，用于貧痧（感冒）、貨煙媽（咽痛）、埃病（咳嗽）、肺癰[4]等；一點紅具有通龍路火路、清熱毒、祛風毒、除濕毒的功效，民間用于發旺（風濕骨痛）、笨浮（水腫）、埃病（咳嗽）、貧痧（感冒）、火眼、貨煙媽（咽痛）、唄農（癰腫）[4]等，與中醫藥理論相符。桑葉對金黃色葡萄球菌等多種致病菌有抑制作用，桑葉含有揮發油，對散熱有良好的療效[5]。從崗梅根中分離得到的10個三萜及其皂苷類化合物，具有顯著的抗炎、抗菌作用[6－7]。千里光具有抗炎、抗菌、抗急性肝損傷、抗癌等顯著的藥理活性[8－10]。

表1 清解霧化液中蘆丁加樣回收試驗結果(n＝6)

表2 樣品測定結果(n＝3)

建立薄層色譜鑒別法時，對桑葉的薄層色譜鑒別分別考察了展開系統甲苯－乙酸乙酯－甲酸（5∶3∶1）[11]、甲苯－乙酸乙酯－甲酸（8∶2∶1）[12]和氯仿－甲醇（13∶1），展開系統氯仿－甲醇（13∶1）分離效果好，斑點清晰，陰性無干擾。對一點紅的薄層色譜鑒別分別考察了展開系統氯仿－甲醇－甲酸（30∶1∶0.1）、甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（5∶4∶1∶1）、甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1），結果甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1）展開系統Rf值適中，因此采用此系統。對崗梅根的薄層色譜鑒別分別考察了甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸酸（10∶3∶1）、甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸酸（5∶2∶1），后者展開效果較好，分離斑點清晰。

建立高效液相色譜法時，根據蘆丁可溶于熱水、甲醇、乙醇的性能，本試驗中采用了不同溶劑水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇提取蘆丁，發現以50%甲醇提取最完全，樣品分離最好，雜峰少。比較了超聲提取時間（20，30，40，60min），發現超聲提取30min即可提取完全，為了節省時間，選擇提取時間為30 min。比較了甲醇－水、甲醇－醋酸和甲醇－磷酸等流動相系統及其比例，結果以甲醇－0.1%磷酸溶液（37∶63）得到的色譜峰分離度最好，基線平整，峰塔板數高，適合該制劑的測定。

本研究中對清解霧化液中的桑葉、崗梅根、一點紅薄層色譜鑒別進行了提取方法和展開劑的篩選，得到的斑點清晰，可用于該制劑的藥材鑒別。采用高效液相色譜法建立了制劑中蘆丁的含量測定方法，操作簡單，準確可靠，為建立清解霧化液的質量標準奠定了基礎。

[1]莫小林，李偉偉，申燕燕，等.壯藥清解霧化液的制備與治療天行赤眼的療效觀察[J].廣西中醫藥，2012，35（1）：39－40.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：82，200，258.

[3]廣西壯族自治區食品藥品監督管理局.廣西壯族自治區壯藥質量標準(第二卷)[M].南寧：廣西科學技術出版社，2011：247.

[4]廣西壯族自治區食品藥品監督管理局.廣西壯族自治區壯藥質量標準(第一卷)[M].南寧：廣西科學技術出版社，2008：120.

[5]蘇方華.桑葉的化學成分及臨床應用研究進展[J].中國醫藥導報，2010，7（14）：9－12.

[6]范文昌，梅全喜，歐秀華，等.12種廣東地產清熱解毒藥材的抗炎作用研究[J].中國藥業，2011，20（8）：28－29.

[7]蔡艷，張慶文，李旨君，等.崗梅根化學成分的研究[J].中草藥，2010，41（9）：1426－1429.

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[9]林萍，易宏偉，張斐.金絲桃苷藥理作用研究進展[J].中國現代中藥，2012，14（10）：23－26.

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[12]丘志春，羅文匯，李養學.大桑菊飲合劑質量標準的研究[J].中國實用醫藥，2010，5（15）：19－20.

Quality Standard of Qingjie A tom ized Liquid

Mo Xiaolin，Wu Xiaoyan，Gong Minyang，Chen Xiaoming，Wei Zhenyuan
（First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning，Guangxi，China 530023）

Objective To establish the quality standard of Qingjie Atomized Liquid.M ethods The Morus Alba，Emilia Sonchifolia and Radix Ilicis Asprellae in the Qingjie Atomized Liquid were identified by thin layer chromatography（TLC）.The content of rutin in the Qingjie Atomized Liquid was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.The column was Discovery C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with mobile phase of methanol－0.1%phosphoric acid solution（35∶65），the detection wavelength was 356 nm，the flow rate was 1.0 m L／min，the column temperature was 35℃.Resu lts The TLC spots of Morus Alba，Emilia Sonchifolia and Radix Ilicis Asprellae were clear and showed negative control without interference.The concentration of rutin is linear in the range of 2－20 g／mL and had a good linear relationship with the peak area，r＝0.999 6，the average recovery was 99.92%，RSD was 0.99%（n＝6）.Conclusion The method is simple，specific and reproducible，which can be used for the quality control of Qingjie Atomized Liquid.

Qingjie Atomized Liquid；quality standard；TLC；HPLC；rutin

R284.1

A

1006－4931(2017)10－0027－04

2017－02－08)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.007

廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項制劑類課題資助項目和醫院制劑遴選課題[GZYZ1104]；全國中藥特色技術傳承人才培訓項目[J20164811007]。

莫小林，副主任中藥師，研究方向為制劑開發和質量標準，（電話）0771－5645433（電子信箱）moxiaolin＠163.com。

伍小燕，主任中藥師，研究方向為中藥鑒定和質量標準，（電話）0771－5848631（電子信箱）yxbwxy＠163.com。