低頻經顱磁刺激對VCI大鼠學習記憶及海馬突觸可塑性的影響

王宏偉 劉寶俊 毛細江 王昌權 涂強 黃毅 路承彪

(1.長江大學醫學院 湖北 荊州 434023； 2.黃河三門峽醫院 兒科 河南 三門峽 472000；3.長江大學第一附屬醫院 NCU 湖北 荊州 434000)

低頻經顱磁刺激對VCI大鼠學習記憶及海馬突觸可塑性的影響

王宏偉1劉寶俊2毛細江1王昌權1涂強3黃毅3路承彪1

(1.長江大學醫學院 湖北 荊州 434023； 2.黃河三門峽醫院 兒科 河南 三門峽 472000；3.長江大學第一附屬醫院 NCU 湖北 荊州 434000)

目的 研究低頻經顱磁刺激(rTMS)對血管性認知障礙(VCI)大鼠學習記憶的影響機制。方法 健康雄性SD大鼠60只，隨機分為正常對照組(normal)、假手術組(sham-operated)、模型組(VCI)、rTMS刺激組(VCI +rTMS)。Morris水迷宮進行行為學認知實驗，電生理學測定大鼠腦片海馬齒狀回(DG)在高頻刺激下(HFS)誘發的突觸長時程增強(LTP)現象。結果 水迷宮實驗中，第4天起rTMS刺激組大鼠逃避潛伏期與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；電生理實驗中，10 min時rTMS刺激組PS幅值升高，LTP幅值變化率與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。結論 rTMS增加VCI大鼠海馬區LTP效應從而增強突觸的功能可塑性，改善VCI大鼠的認知功能?！娟P鍵詞】 低頻經顱磁刺激；血管性認知障礙；海馬；學習記憶；長時程增強

隨著老齡化的到來，我國卒中發病率日益增加。卒中患者中高達64%伴有不同程度的認知功能障礙，進展為血管性癡呆的可能性也成倍增加[1]。血管性癡呆(vascular dementia, VD)對老年人的健康和生活質量造成極大威脅，給社會家庭帶來沉重的負擔[2]。VD臨床表現為認知和記憶功能障礙。記憶認知與中樞神經突觸的可塑性變化密切相關。中樞突觸LTP是神經突觸功能可塑性的一個重要表現形式，反應了突觸水平的記憶過程，是腦科學研究中衡量突觸功能可塑性的主要指標[3]。海馬作為研究學習記憶功能的關鍵部位是具有可塑性的一個重要腦區。Morris水迷宮檢測的大鼠學習記憶能力是一種空間參考記憶，屬于陳述性記憶，癡呆患者正是表現為陳述性記憶受損明顯。低頻經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)是近年逐漸應用于臨床的一種影響和改變大腦功能的生物刺激技術，作為一種新型治療手段已在多種神經精神疾病的治療中得到了肯定。

實驗擬以模型組血管性認知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)大鼠為研究對象，從行為學和電生理實驗兩方面探討低頻rTMS對VCI大鼠學習認知能力和對大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區突觸長時程增強(long-term potentiation，LTP)為指標的突觸可塑性的影響，希望為血管性認知障礙患者的治療提供新的實驗依據和治療手段。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 經顱磁刺激治療儀、Morris水迷宮系統、人工腦脊液(配置)、LEICA VT1200S 振動切片機、DS3電子刺激器、SS-202J刺激隔離器、NL104信號放大器、Micro140生物信號處理器、Spike2數據分析軟件。

1.2 動物及分組 2個月齡大雄性SD大鼠60只，隨機等分為正常組、假手術組、模型組、rTMS刺激組。實驗大鼠購自湖北省疾控中心實驗動物中心。

1.3 模型大鼠制備 采用反復夾閉及再通雙側頸總動脈伴低血壓法模擬反復腦缺血，制備大鼠血管性癡呆模型。參照王蕊等[4]方法制作VCI動物模型。大鼠術前12 h禁食，4 h禁水，1%戊巴比妥納腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術臺上，常規消毒，頸部正中切口分離雙側頸總動脈(common carotid arteries，CCA)，模型組在夾閉雙側CCA前，腹腔內注射硝普鈉(2.5 mg/kg，用雙蒸餾水溶解)，隨即用無創動脈夾夾閉雙側CCA 10 min，再通10 min，再夾閉10 min，縫合傷口放回籠中保溫繼續飼養。假手術組僅分離雙側頸總動脈，不夾閉雙側CCA及腹腔注射硝普鈉。傷口撒磺胺粉預防感染，手術結束后飼養7 d。

1.4 低頻經顱磁刺激方法 造模成功后，治療采用低頻1 Hz，10個脈沖/串，每串間隔2～3 s，20串/d，強度為0.5 T，1個療程為5 d，共4個療程，每個療程間隔2 d。實驗過程中rTMS刺激組大鼠均有很好耐受性，未見異常現象發生。

1.5 Morris水迷宮實驗 大鼠適應環境后開始，實驗持續5 d，大鼠向池壁不同象限入水，記錄在120 s內大鼠尋找到平臺所用的時間(即逃避潛伏期)。結果以大鼠尋找到站臺的時間表示。120 s內未能找到平臺，潛伏期記為120 s。

1.6 電生理學實驗

1.6.1 大鼠腦片制備 斷頭取腦，振動切片機切制成含海馬層面的活體腦片，置于灌流有95%O2+5%CO2混合氣體與人工腦脊液的灌流槽內。刺激電極置于大鼠內嗅區前穿通纖維區，記錄電極置于海馬齒狀回。調整刺激電極和記錄電極的位置，找到固定強度的刺激記錄到最大的群峰電位(population spike、PS)時將兩電極固定。刺激由DS3電子刺激器產生，經刺激隔離器和刺激電極輸向前穿通纖維區，誘發的動作電位經生物放大器在記憶示波器上顯示，輸入計算機經Spike2數據分析軟件進行分析作為齒狀回顆粒細胞群興奮性的指標[5]。

2 結果

2.1 低頻rTMS對各組大鼠水迷宮實驗中逃避潛伏期的影響 實驗中VCI模型組大鼠逃避潛伏期一直處在較高的水平。 第1、2天，各組在大鼠逃避潛伏期比較，差異無統計學意義(P>0.05)。第3天開始，各組大鼠逃避潛伏期有顯著縮短，正常組大鼠逃避潛伏期與假手術組和模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。第4天時，rTMS刺激組逃避潛伏期與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 水迷宮實驗中大鼠逃避潛伏期比較±s，s)

注：模型組與假手術組、正常組比較，aP<0.01；模型組與rTMS組比較，bP<0.05。2.2 低頻rTMS對各組大鼠海馬DG區HFS誘導的LTP的影響 各組在給予HFS后PS幅值變化率均出現增加，記錄時間內未見明顯減弱。各時間節點上VCI模型組PS幅值變化率與正常組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。10 min時，rTMS刺激組PS幅值變化率開始較大幅度增加，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.01)；假手術組與正常組PS幅值變化率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，表明手術操作對大鼠海馬LTP無影響。見圖1、2。

注：正常組與模型組比較，cP<0.05；rTMS刺激組與模型組比較，dP<0.01。

圖2 HFS刺激前后變化圖(MN為PS變化幅度，A：HFS前，B：HFS后)

3 討論

血管性癡呆和阿爾茨海默病是引起癡呆的兩大主要原因。癡呆已成為一個越來越嚴峻的社會、經濟、家庭以及公共衛生問題。關于學習、記憶等認知缺陷的修復是當今世界上腦科學研究的一個熱點。但與阿爾茨海默病變性為主的病理改變不同的是血管性癡呆病因多、病理機制復雜，臨床治療中束手無策，無特效的藥物和治療辦法。

rTMS通過線圈內電流的瞬變從而形成高強度的交變磁場，可在深部腦區產生感應電流而起作用[6]。作為非藥物干預技術已應用于一些神經和精神系統疾病的治療并取得了不錯的效果[7]。實驗中經低頻rTMS刺激的大鼠都表現出很好的耐受性。但目前在血管性認知障礙機制方面有關rTMS的研究報道較少。

實驗在動物行為學和電生理學方面為rTMS的臨床應用提供了理論依據。VCI模型大鼠表現為學習記憶能力下降。在低頻rTMS刺激后VCI大鼠學習記憶能力改善。神經細胞之間的突觸可塑性變化則是學習記憶的神經生物學基礎。海馬齒狀回LTP明顯增加，表明低頻rTMS刺激可使VCI大鼠海馬DG區的神經突觸間功能可塑性增強。這可能是rTMS改善VCI大鼠認知學習功能的分子突觸機制。rTMS豐富了當前VCI的治療手段，眾多的血管認知障礙患者或許會從中受益，在突觸結構可塑性方面仍要進一步探索研究完善。

[1] Seshadri S,Beiser A,Kelly-Hayes M,et al.The lifetime risk of stroke:estimates from the Framingham Study[J].Stroke,2006,37(2):345-350.

[2] Kalaria R N,Maestre G E,Arizaga R,et al.Alzheimer's disease and vascular dementiain developing countries:prevalence,management,and risk factors[J].Lancet Neurol,2008,7(9): 812-826.

[3] Morris R G.Elements of a neurobiological theory of hippocampal function:the role of synaptic plasticity,synaptic tagging and schemas[J].Eur J Neurosci,2006,23(11):2829-2846.

[4] 王蕊,楊秦飛,唐一鵬,等.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進[J].中國病理生理雜志,2000,16 (10):914-916.

[5] Gruart A,Munoz M D,Delgado-Garcia J M.Involvement of the CA3-CA1 synapsein the acquisition of associative learning in behave mice[J].Neuroscience,2006,26(4):1077-1087.

[6] 戶東梅,程肖蕊,周文霞,等.重復經顱磁刺激對腦卒中后認知功能障礙治療的研究進展[J].生理科學進展,2012,43(6):411-416.

[7] Zhang B,Chen X,LinY,et al.Impairment of synaptic plasticity in hippocampus is exacerbated by methylprednisolone in a rat model of traumatic brain injury[J].Brain Res,2011,1382:165-172.

Effects of low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation on learning and memory and synaptic plasticity in hippocampus of vascular cognitive impairment rats

Wang Hongwei1, Liu Baojun2, Mao Xijiang1, Wang Changquan1, Tu Qiang3, Huang Yi3, Lu Chengbiao1

(1.MedicalCollegeofYangtzeUniversity,Jingzhou434023,China; 2.DepartmentofPediatrics,HuangheSanmenxiaHospital,Sanmenxia472000,China; 3.DepartmentofNCU,theFirstAfflicatedHospitalofYangtzeUniversity,Jingzhou434000,China)

Objective To study the effect of low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) on learning and memory and the long-term potentiation (LTP) in hippocampus of vascular cognitive impairment(VCI) rats. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into normal group, sham-operated group, model group(VCI), control treatment group(VCI+ rTMS). The spatial learning and memory ability of rats was measured by Morris water maze. Electrophysiological recordings were conducted to detect the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation(rTMS)on phenomena of synaptic transmission long-term LTP in dentate gyrus (DG) of hippocampus slices under the high frequency stimulation (HFS). Results In the escape latency after the 4th days, the rTMS treatment group was shortened to the model group (P<0.05).10 minutes later, the PS amplitude of the control treatment group increased and the LTP was enhanced, there were significant difference compared with model group(P<0.01). Conclusion The rTMS can improve VCI model rats learning and memory ablity by means of enhancing hippocampal LTP and the function of synaptic plasticity.

repetitive transcranial magnetic stimulation ；vascular cognitive impairment；hippocampus；learning and memory；long-term potentiation

路承彪，E-mail：2331202185@qq.com。

R 743.9

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.08.002

2016-11-30)