MicroRNA-187在膠質瘤中的表達及對預后判斷的價值

高未華 樊銳太

(鄭州大學第一附屬醫院 放療科 河南 鄭州 450052)

MicroRNA-187在膠質瘤中的表達及對預后判斷的價值

高未華 樊銳太

(鄭州大學第一附屬醫院 放療科 河南 鄭州 450052)

目的 探討microRNA-187(miR-187)在不同級別膠質瘤的表達及其與臨床病理參數和預后的關系。方法 收集鄭州大學第一附屬醫院53例不同病理級別的膠質瘤及10例正常腦組織標本，通過qRT-PCR檢測miR-187的表達水平；分析miR-187表達量與膠質瘤患者臨床病理參數的相關性；通過Kaplan-Meier分析及log-rank檢驗評價不同表達水平與生存期的關系。結果 與正常腦組織相比，miR-187低表達于膠質瘤組織(P<0.05)，miR-187在膠質瘤組織中的表達水平與腫瘤大小、WHO分級、KPS評分和增殖分數Ki-67相關(P<0.05)，與患者的年齡，性別及腫瘤部位無關(P>0.05)，在生存分析中，低表達miR-187的膠質瘤患者預后較差。結論 miR-187在膠質瘤細胞中的表達水平顯著降低，與腫瘤大小、WHO分級、增殖分數Ki-67和KPS評分及預后密切相關。miR-187在膠質瘤的診斷與治療中有重要意義，可能作為新型膠質瘤預后相關的分子靶標。

膠質瘤；miR-187；預后

膠質瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤，年發病率為4～5/10萬，具有高侵襲性、高死亡率的特點，不同病理類型的膠質瘤預后存在差異，其中間變型星形細胞瘤中位生存期為2～5 a，而惡性程度最高的膠質母細胞瘤僅為12～15個月[1]。近年來，采用手術結合放化療的綜合療法顯著提高了膠質瘤的治療效果，但其預后仍不容樂觀，進一步探索與膠質瘤診斷與預后相關的新型生物標記物，會為膠質瘤的精確治療提供新的思路。

MicroRNA(miRNA)是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，其在轉錄后水平上調節靶基因的表達，參與多種生理和病理功能的調控[2]。目前有研究表明，miR-187的異常表達與乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、腎癌[5]及結直腸癌[6]等多種腫瘤相關，而miR-187在膠質瘤中的作用尚無報道。故本文旨在研究miR-187在膠質瘤不同病理級別中的表達水平及預后價值，為進一步探索腦膠質瘤基因治療的潛在靶點提供方向。

1 資料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本收集 運用隨機抽樣方法選取鄭州大學第一附屬醫院2013年9月至2014年9月膠質瘤標本53例，其中男35例，女18例，中位年齡為52歲(38～79歲)。根據WHO分級，其中低級別膠質瘤22例，Ⅰ級6例，均為腦膜瘤。Ⅱ級16例，包括彌漫性星形細胞瘤9例，少突膠質細胞瘤7例。高級別膠質瘤31例，Ⅲ級17例，包括間變性少突膠質細胞瘤10例，混合性膠質細胞瘤7例。Ⅳ級14例，均為膠質母細胞瘤。另選取同期因腦出血、腦外傷切除的正常腦組織10例作為對照組。每例標本先經液氮臨時保存，然后-80 ℃儲存以備提取組織總RNA。所有標本均經病理學證實，入組患者術前均未進行過放化療等治療。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑及儀器 TRIzol總RNA提取試劑購于美國thermo公司；miRNA反轉錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購自日本TAKARA公司；Real-time PCR引物購自上海生工合成；熒光定量PCR儀購于賽默飛世爾科技公司。

1.2 Real-time PCR 分別取液氮中保存的膠質瘤組織，正常腦組織，用TRIzol提取總RNA，提取后使用核酸定量儀測定濃度及純度，而后置于-80 ℃的冰箱中保存，所有操作參照說明書及參考文獻。用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉錄。PCR擴增的步驟如下：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s后60 ℃ 10 s，進行40個循環，于4 ℃保存。每個樣品3個重復孔，目的產物的量通過公式2-△△CT計算。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0統計學軟件分析數據，采用GraphPad Prism繪制統計圖，組間對比采用t檢驗，相關性分析采用χ2檢驗，利用Kaplan-Meier法及Log-Rank檢驗進行生存分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-187低表達于膠質瘤組織 利用Real-time PCR技術檢測不同級別的膠質瘤組織和正常腦組織中miR-187的相對表達量，結果表明，腦膠質瘤組織，正常腦組織中miR-187的表達量分別為(0.836 8±0.604 2)比(2.406 2±0.944 1)，與正常腦組織相比，miR-187在腦膠質瘤中低表達(P<0.05，t=5.065)。且miR-187在高級別膠質瘤中的表達明顯低于低級別膠質瘤(P<0.05，t=2.043)。

2.2 miR-187表達與膠質瘤相關性分析 根據miR-187表達水平對53例膠質瘤組織樣本分組，表達量的平均數為0.836 8，高表達組指miR-187表達水平高于平均水平的患者，共30例，其余為低表達組，共23例。結果提示，膠質瘤組織中miR-187的表達水平與腫瘤大小、WHO分級、增值分數Ki-67和KPS評分密切相關，差異有統計學意義(P<0.05)，與患者的年齡，性別及腫瘤部位差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 miR-187表達與患者預后的關系 53例膠質瘤患者隨訪截止至2016年3月或死亡，低表達組中位生存期為12.4個月，高表達組為23.1個月。結果顯示，miR-187高表達組的預后明顯優于低表達組，差異有統計學意義(HR=2.532，95%CI：1.206～5.313，P<0.05)。見圖1。

表1 膠質瘤患者miR-187表達量與臨床病理參數的相關性

圖1 miR-187高/低表達組膠質細胞瘤患者的K-W曲線

3 討論

miRNA是核苷酸片段構成的內源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與細胞內特定mRNA的3’-UTR 堿基配對結合，影響蛋白質的翻譯過程，調節相關蛋白質在生命體中的表達水平[7]，在細胞的生長、分化、增殖和凋亡等過程中均發揮著重要作用。目前已明確腫瘤細胞中存在多種miRNA分子片段，不同miRNA產生的生物學效應也不一樣，表達水平也存在差異。在膠質瘤細胞中miR-210、miR-155、miR-132和miR-200a顯示高表達，而miR-34a、miR-206、miR-200b和miR-134顯示低表達[8]。

目前研究發現，miR-187可能具有細胞或器官特異性[9]，在不同組織、器官中表達存在差異。miR-187在卵巢癌中高表達與較好的生存率相關，但在宮頸癌HeLa細胞中，miR-187過表達將誘使細胞失活甚至凋亡[10]，不同的腫瘤類型中miR-187表達水平的差異提示我們需要進一步證實miR-187在其他腫瘤中的表達變化與發病機理。雖然已有學者針對一些miRNA在膠質瘤發生發展中的影響進行了研究，但miR-187在膠質瘤中的表達情況并不明了。

研究證實，在肺癌細胞中miR-187通過阻礙細胞從G1向S期轉化阻止癌癥進展，其中B7-H3被證實是miR-187的轉錄產物，B7-H3是一類通過激活jak2/STAT3通路的致癌基因，可促進腫瘤增殖與轉移，miR-187通過沉默B7-H3使細胞周期停止于G0/G1期，從而減緩細胞增殖[11]。同時也有研究發現miR-187可抑制晚期結直腸癌細胞的上皮間質化轉變，從而提高患者生存率[12]。近年來，miR-187在各種實體腫瘤中的生物學特性逐漸被重視，隨著其調控機制及對細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移的研究不斷深入，其醫學價值不斷提升。本課題首次探索miR-187在腦膠質瘤組織中的表達情況，進一步明確其生物學特性，利用其高度敏感性及特異性的優勢，探究其能否成為臨床上指導治療，提示預后的生物學指標，為今后進一步明確miR-187在膠質瘤細胞中的分子生物學機制打下了夯實的基礎，給腦膠質瘤的臨床診療工作提供新的思路。

本研究通過qRT-PCR分析了miR-187在不同級別的腦膠質瘤及正常腦組織的表達情況，深入探討miR-187在腦膠質瘤中的表達水平與各項臨床病理參數之間的關系。經過統計學分析，發現miR-187在高級別膠質瘤組織(WHO Ⅲ、Ⅳ級)的表達水平明顯低于低級別膠質瘤(WHO Ⅰ、Ⅱ級)和正常腦組織(P<0.05)。隨著膠質瘤病理級別的增高，miR-187的表達水平顯著性降低，提示miR-187與腦膠質瘤的發生發展密切相關。相關性統計分析顯示，miR-187與膠質瘤的惡性程度負相關，膠質瘤組織引起miR-187表達水平受到抑制，且隨著膠質瘤惡性程度增加，miR-187受抑制程度也逐漸增大。與此同時，miR-187與腫瘤大小、增殖分數Ki-67負相關，與KPS評分正相關。腫瘤形態越大，Ki-67數值越高意味著miR-187表達水平相對越低，而身體情況較好，KPS評分較高的患者其miR-187表達水平也相對較高(P<0.05)。Kaplan-Meier分析結果進一步驗證了miR-187表達水平越低，提示生存預后越差。基于目前的研究成果，我們有理由推斷miR-187表達水平越低，抑制腫瘤細胞凋亡、轉移及侵襲的能力越差，膠質瘤患者預后也越差。

綜上，本研究首次證實了miR-187在人膠質瘤組織中低表達且與預后相關。膠質瘤中miR-187低表達意味著生存率低，提示miR-187可能成為膠質瘤侵襲及預后特異標志物及治療靶點，為膠質瘤的診治提供了新的實驗依據及方向，但miR-187在膠質瘤中低表達相關分子機制仍不明確，因此，其下游靶基因是本課題進一步的研究方向。

[1] Zhao W,Wang C,Wang J,et al.Relationship between cacyBP/SIP expression and prognosis in astrocytoma[J].J Clin Neurosci,2011,18(9):1240-1244.

[2] Zen K,Zhang C Y.Circulating microRNAs: a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers [J].Med Res Rev,2012,32(2):326-348.

[3] Mulrane L,Madden S F,Brennan D J,et al.MiR-187 is an independent prognostic factor in breast cancer and confers increased invasive potential in vitro[J].Clin cancer Res,2012,18(24):6702-6713.[4] Casanova-Salas I,Masia E,Arminan A,et al.MiR-187 Targets the Androgen-Regulated Gene ALDH1A3 in Prostate Cancer [J].PLoS One,2015,10(5):e0125576.

[5] Zhao J,Lei T,Xu C,et al.Micro RNA-187,down-regulated in clear cell renal cell carcinoma and associated with lower survival,inhibits cell growth and migration though targetingB7-H3[J].Biochem Biophys Res Commun, 2013,438(2):439-444.

[6] Zhang F,Luo Y,Shao Z,et al.MicroRNA-187,a downstream effector of TGFβ pathway,suppresses Smad-mediated epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer [J].Cancer Lett,2016,373(2):203-213.

[7] Liu X,Zheng Q,Vrettos N,et al.A MicroRNA precursor surveillance system in quality control of MicroRNA synthesis[J].Mol Cell,2014,55 (16):868-879.

[8] Lai N S,Dong Q S,Ding H,et al.MicroRNA-210 overexpression predicts poorer prognosis in glioma patients[J].J Clin Neurosci,2014,21(5):755-760.

[9] Zhao J,Lei T,Xu C,et al.MicroRNA-187,down-regulated in clear cell renal cell carcinoma and associated with lower survival,inhibits cell growth and migration though targetingB7-H3[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,438(2):439-444.

[10] Park S Y,Lee J H,Ha M,et al.MiR-29 miRNAs activate p53 by targeting p85 alpha and CDC42[J].Nat Struct Mol Biol,2009,16 (1):23-29.

[11] Sun C,Li S,Yang C,et al.MicroRNA-187-3p mitigates non-small cell lung cancer (NSCLC) development through down-regulation of BCL6[J].Biochem Biophys Res Commun, 2016,471(1):82-88.

[12] Zhang F,Luo Y,Shao Z,et al.MicroRNA-187,a downstream effector of TGFβ pathway,suppresses Smad-mediated epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer [J].Cancer Lett,2016,373(2):203-213.

Expression of microRNA-187 in glioma tissue and its value in predicting prognosis

Gao Weihua, Fan Ruitai

(DepartmentofRadiotherapy,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To investigate the prognostic roles of ectopic expression of miR-187 in glioma, and the relationship between miR-187 expression level and clinical significance.Methods The specimens from the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University were collected, including 53 glioma tissues, 10 cases of normal brain tissues. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to measure the expression of miR-187 in all specimens. In addition, the clinical pathological features of gliomas were reviewed, and the correlation between the features and the expression of miR-187 were analyzed. Survival curves of the patients were calculated using the Kaplan-Meier method and the data were analyzed with the log-rank test.Results The results revealed that miR-187 expression level in glioma tissues was significantly lower than those in normal brain tissues (P<0.05). Moreover, higher expression of miR-187 was significantly associated with larger tumor size, higher WHO grade, lower Karnofsky performance score (KPS), and higher percentage of Ki-67(P<0.05).Conclusion MiR-187 down-regulation was associated with negatively pathological grade, large tumor, over-expression of Ki-67, and low KPS. It is the first data to prove that expression level of miR-187 may be a novel and valuable prognostic factor in glioma.

miR-187；glioma；prognosis

R 739.41

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.08.006

2016-12-03)