海南三亞豇豆枯萎病病原菌鑒定及室內藥劑篩選

李秋潔+符啟位+王爽+黃國宋+劉勇+葉其宏+吳乾興+孔祥義

摘 要 通過形態學觀察、致病性測定和 ITS 序列分析對海南三亞地區采集的豇豆枯萎病病原菌進行鑒定，將豇豆枯萎病病原鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。進行10種常用藥劑對病原菌的毒力測定試驗，結果表明：乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅3種藥劑對豇豆枯萎病具有較好抑制作用，其EC50值分別為47.42、33.58、74.26 μg/mL；EC90值分別為196.69、325.26和581.06 μg/mL；a值分別為2.074 4、1.299 6和1.434 4，表明豇豆枯萎病病原菌對該3種藥劑較為敏感。

關鍵詞 豇豆 ；枯萎病 ；病原鑒定 ；藥劑篩選

中圖分類號 S643.4；S436.43 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.06.009

Pathogenic Identification and Indoor Screening of Cowpea Fusarium

Wilt in Sanya， Hainan Province

LI Qiujie FU Qiwei WANG Shuang HUANG Guosong

LIU Yong YE Qihong WU Qianxing KING Xiangyi

（Sanya Science and Technology Academy for Crop Winter Multiplication， Sanya， Hainan 572000）

Abstract Isolatesstrains of cowpea fusarium wilt collected from cowpea in Sanya were identified by using the morphological description， pathogenicity testing in vivo and ITS sequence analysis. These isolates were identified to be Fusarium oxysporum. The toxicity of 10 fungicides against the isolateswas tested. The results showed that ethylicin， thiophanate methyl and mancozeb had better inhibiting effect on fusarium wilt with their EC50 values being 47.42， 33.58， 74.26 μg/mL， respectively， and their EC90 values being 196.69， 325.26， 581.06 μg/mL， respectively， as well as their a values being 2.074 4， 1.299 6 and 1.434 4， respectively. This indicated that the isolates were sensitive to these three fungicides.

Keywords cowpea ； Fusarium wilt ； pathogenic identification ； screening of fungicides

豇豆營養豐富，口感好，是大眾餐桌上常見的蔬菜品種。其種植范圍廣泛，在中國湖北、福建、廣西、海南等地均有大面積種植，尤其在海南三亞地區，豇豆種植面積已達5 340 hm2，出島產量達 15 萬t[1]，成為該地冬種北運的主角，對該地的農業經濟發展起到積極的促進作用。但隨著三亞豇豆產業的發展，病蟲害成為阻礙豇豆產業發展的重要因素，尤其是豇豆枯萎病，嚴重影響了豇豆的產量與品質。近年來，由于多年連作，土壤條件惡化，三亞市豇豆枯萎病大面積流行，造成豇豆大量減產。

枯萎病是一種毀滅性土傳病害，植株一旦發病，往往造成整株枯萎死亡。目前，已有多個研究報道香蕉、大豆、黃瓜、甜瓜、西瓜、甘藍等多種經濟作物均可發生枯萎病，枯萎病的病原主要為尖孢鐮刀菌，不同作物的枯萎病病原專化型不同，且同種作物下病原菌存在小種分化現象[2]。2012年，吳仁鋒對武漢市豇豆枯萎病分離后鑒定為尖孢鐮刀菌[3]。2015年肖敏將海南樂東地區的豇豆枯萎病病原鑒定為尖孢鐮刀菌菜豆專化型（Fusarium oxysporum f. sp. phaseolus）[4]。本研究對海南三亞豇豆主產區采集到的病原菌分離物進行鑒定，并開展室內藥劑篩選試驗，以確定病原菌種類，并比較分析這些殺菌劑對該病菌生長的影響，以期為生產中防治豇豆枯萎病提供指導與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株于2016 年12月從海南省三亞市崖州區豇豆地枯萎病發病樣本上采集分離到，經病健交界處組織分離和純化培養后，純化菌株于無菌水中常溫保存備用。

1.1.2 供試藥劑

供試藥劑詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及其形態觀察

選取新發病植株的根莖部位，在病健交界處，剪取5 mm大小的組織，參照文獻[5]中有關病原真菌的分離方法，進行常規組織分離，經劃線分離純化獲得單孢菌株。在PDA培養基上，28℃恒溫培養箱培養7 d后，觀察菌落形態及分生孢子形態。

1.2.2 病原菌致病性測定

病原菌在PDB培養基震蕩培養7 d后，過濾獲得孢子懸浮液，將濃度調至108個/mL。采用傷根接種法接種植株。取長勢一致，長出3～4片真葉的豇豆幼苗，用無菌水將根部表面沖洗干凈，用消毒的剪刀剪掉少許根尖，然后使根完全浸在孢子懸浮液中30 min，最后將植株定植于椰糠基質的花盆中，剩余懸浮液澆灌幼苗根部。每個菌株接種6株苗，設置2次重復，以無菌水為對照。正常栽培管理，10 d后觀察發病情況。發病后，從病株再次分離病原菌，確認致病菌。

1.2.3 病原菌ITS序列分析鑒定

（1）菌絲收集 病原菌在PDA平板培養4 d后，用滅菌藥匙刮取菌絲，置于4℃保存備用。

（2）DNA提取 CTAB法提取病原菌DNA，將50 mg菌絲體放入已滅菌的2 mL離心管內，每一離心管中加入600 μL 2×CTAB提取緩沖液（0.7 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA；20 g/L CTAB），用電鉆將菌絲磨碎后，渦旋混勻，65℃水浴鍋中溫浴30 min，期間顛倒混勻3次。每管加入600 μL氯仿/異戊醇（體積比24∶1）抽提液，充分混勻后，于12 000 r/min離心15 min。吸取上清液至干凈離心管中，加等體積氯仿/異戊醇再抽提1次。將上清轉入干凈的離心管中，加2倍體積的無水乙醇沉淀20 min，12 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用70%冰乙醇沖洗2遍。將離心管置于37℃溫箱中干燥后用TE溶解沉淀，經1%脂糖凝膠電泳檢測后-20℃冰箱保存，備用。

（3）ITS特異序列擴增 用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。其序列為，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反應條件 PCR反應體系總體積為50 μL，反應液組分：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 24 μL，10 mmol/L d NTP 2 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和 ITS4 （25 μmol/L）各1 μL，用dd H2O使總體積達到50 μL。擴增條件：95℃預變性3 min；94℃變性1 min；56℃退火1 min；72℃延伸30 s，共30個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物委托深圳華大基因公司純化和測序。

（4）ITS序列分析 將測序所得ITS序列與GenBank 中核酸數據庫中的ITS區相關序列進行同源性比較。

1.2.4 供試藥劑對病原菌的毒力測定

在預備試驗的基礎上，選擇各藥劑對豇豆枯萎病病菌菌絲體生長具有一定抑制作用的4～5個濃度，作為各藥劑的供試濃度。供試藥劑用無菌水稀釋成不同濃度的藥液，將PDA培養基熔化，冷卻至50℃左右，按照各藥劑所需濃度加入適量的藥液，倒入滅菌培養皿制成含藥平板。每種藥劑每個濃度設置3次重復，以加無菌水PDA培養基作空白對照。用直徑為5 mm的打孔器打取生長一致的菌餅，置于含藥平板中央，28℃恒溫培養，待對照菌絲體直徑至少 4 cm 以上但不長滿皿時，采用十字交叉法測量每個處理的菌落直徑，計算生長抑制率，分析不同殺菌劑對供試病菌菌絲生長的影響。其中，生長抑制率=[（對照菌落直徑-0.5）-（處理菌落直徑-0.5）]/（對照菌落直徑-0.5）×100%。再根據生物統計幾率值換算表，將抑制百分率換算成抑制幾率值。以試驗中設定的濃度對數為橫坐標，抑制幾率值為縱坐標，計算不同殺菌劑對相應菌株的劑量反應回歸方程y=ax+b，并由回歸方程計算各藥劑對相應菌株的抑制中濃度EC50、EC90及相關系數r值與斜率a值。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離與菌落形態

病原菌在PDA培養基上28℃培養6～7 d后，菌落呈規則圓形，邊緣白色，中間淡紫色，氣生菌絲茂盛，絨毛狀，背面淺紫色，可見同心圓環。挑取菌絲在顯微鏡下觀察可見大量分生孢子，存在2種分生孢子：大型分生孢子、小型分生孢子。大型孢子頂細胞漸尖并彎曲成喙狀，基細胞足狀，多數為3隔，大小為20.25 μm×4.2 μm；小型孢子數量多，單胞，橢圓形或腎型，大小為8.25 μm×3.01 μm，分生孢子梗在菌絲上直接長出，單瓶梗。厚垣孢子在生長后期出現，球形，間生或頂生。通過對菌落形態、孢子形態等觀察，初步鑒定病原菌為尖孢鐮刀菌，見圖1。

2.2 病原菌致病性測定

接種病原菌孢子懸浮液的豇豆幼苗，植株長勢瘦弱，接種10 d，葉片開始變黃萎蔫，13 d 后，葉片皺縮陸續掉落，植株萎蔫枯死，莖基部及根部切面變褐。15 d后，殘留的發病殘株莖基部可見粉色孢子堆。對照無此癥狀。對發病植株進行鏡檢和再次組織分離，獲得的菌株與接種的菌株形態一致，證明分離物即為豇豆枯萎病病原，見圖2。

2.3 病原菌ITS序列分析鑒定

利用真核通用引物ITS1和ITS4引物進行ITS特異序列擴增，擴增條帶位于500～750 bp，約600 bp。測得的序列大小為518 bp在 NCBI 網站比對發現：該 序 列 與Genbank中 的Fusarium oxysporum（登錄號為：KX009490.1，GQ121287.1）的相應片段同源性最高，同源性為99%。根據比對結果及形態觀察，將該菌鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum. Schl）

2.4 不同供試藥劑對病原菌的室內毒力測定

采用10種常用藥劑對海南三亞地區的豇豆枯萎病病原菌進行毒力測定，試驗結果表明，10種藥劑對病原菌菌絲生長均有一定的抑制作用，其中，甲基硫菌靈、乙蒜素、苗迎春3種藥劑對病原菌菌絲生長抑制作用明顯，其EC50分別為33.58、47.42、51.90 μg/mL。 根美、代森錳鋅、百菌清對病原菌菌絲生長的抑制作用也較明顯，EC50值分別為53.53、74.26、83.86 μg/mL。為進一步確定供試藥劑對豇豆枯萎病病菌的抑制作用，對10種藥劑的EC90進行分析比較。其中，EC90值小于500 μg/mL的有2種藥劑，分別為乙蒜素、甲基硫菌靈，其EC90值為196.69、325.26 μg/mL。EC90值大于500 μg/mL小于1 000 μg/mL的有代森錳鋅、苗迎春，其EC90值為581.06、669.59 μg/mL。

毒力回歸曲線的斜率（a值）越大，病原菌對殺菌劑越敏感[6]。10種藥劑的毒力回歸方程a值范圍在0.461 7～2.074 4，a值最大的供試藥劑為乙蒜素，a值為2.074 4；其次是代森錳鋅，a值為1.434 4；然后是甲基硫菌靈，a值為1.299 6。

綜合比較EC50、EC90、a值發現，乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅EC50值、EC90值均較小，對豇豆枯萎病病原菌抑制作用較強。而且，a值相對較大，豇豆枯萎病病原菌對該3種藥劑較為敏感，見表2。

3 討論

豇豆枯萎病是豇豆生產常見的土傳病害，在海南三亞市豇豆主產區發生嚴重，田間發病率一般在 5%～20%，嚴重時達30%以上，甚至絕收。本研究從病原菌形態、致病力測定、ITS序列分析將海南三亞地區的豇豆枯萎病病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌菌，與吳仁鋒等[3]、肖敏等[4]的研究結果一致。但尚未能確定病原菌的專化型種類，有待下一步研究。

枯萎病作為一種嚴重的土傳病害，曾造成多種經濟作物的大量減產，目前多數研究對于枯萎病的防治傾向于抗病育種研究，但由于抗病育種需要時間長，且抗病品種容易喪失抗性，因此，在生產實踐上，化學防治仍然處于不可代替的地位，生物藥劑協同化學藥劑防治病蟲害也是另一個新的思路。本研究開展了10種常見藥劑對豇豆枯萎病的毒力測定試驗，結果表明：乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅3種藥劑對豇豆枯萎病具有較好抑制作用，其EC50值分別為47.42、33.58、74.26 μg/mL；EC90值分別為196.69、325.26、581.06 μg/mL；a值分別為2.074 4、1.299 6、1.434 4，表明豇豆枯萎病病原菌對該3種藥劑較為敏感。乙蒜素是大蒜提取物，作為一種仿生植物農藥，既對環境友好，又能壯根壯苗，促進植物生長，光譜高效，對多種植物病原菌具有較強抑制作用。張博等[7]發現，乙蒜素在室內或田間條件下對馬鈴薯致病疫霉菌均具用抑制效果。本研究中，甲基硫菌靈對豇豆枯萎病表現出較強抑制作用，甲基硫菌靈是一種苯并咪唑類殺菌劑，有研究表明，長期單一使用同一種苯并咪唑類殺菌劑，容易導致病原菌產生抗性[8]。因此，在生產中不宜長期單一使用甲基硫菌靈防治豇豆枯萎病。

根據本研究結果，在生產實踐中防治豇豆枯萎病建議使用乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅輪換使用，可達到良好的防治效果，同時避免產生抗藥性。

參考文獻

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[3]吳仁鋒，楊紹麗，萬 鵬，等. 豇豆枯萎病病原分離鑒定[J]. 湖北大學學報（自然科學版），2012，34（1）：100-104.

[4] 肖 敏，曾向萍，嚴婉榮，等. 海南豇豆枯萎病病原鑒定及生物學特性初步研究[J]. 基因組學與應用生物學，2015，34（2）：345-349.

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