基于超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)大麻植物中3種成分及化學(xué)表型分析

孫維來(lái)++鄭曉雨++趙彥彪++曾令華++高利生++鄭琿++劉耀

摘要建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/PDAQDa）同時(shí)對(duì)大麻植物中Δ9四氫大麻酚（Δ9THC）、大麻酚（CBN）和大麻二酚（CBD）進(jìn)行定性與定量分析的方法。繳獲的大麻植物用甲醇超聲萃取， 采用甲醇（含0.1%甲酸）和超純水為流動(dòng)相， 等度洗脫， 流速為0.2 mL/min， 經(jīng)Waters UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）分離， 利用光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA）在220 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)， 并通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)器（QDa）對(duì)目標(biāo)洗脫峰進(jìn)行追蹤確證。在0.5～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)， 3種大麻酚類(lèi)化合物的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系， R≥0.999； 低、中、高添加水平的平均回收率為82%～102%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.4%～4.1%之間。本方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、靈敏， 能夠滿足檢測(cè)需求。根據(jù)Δ9THC、（Δ9THC+CBN）/CBD、Δ9THC/CBD或CBN/CBD表型指數(shù)， 區(qū)分不同產(chǎn)地大麻的化學(xué)表型， 為大麻植物的檢測(cè)分析和質(zhì)量控制提供了有效手段。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 大麻植物； Δ9四氫大麻酚； 大麻酚； 大麻二酚； 化學(xué)表型

1引 言

大麻植物是非法加工制造大麻制品的基本原料。大麻中的大麻酚類(lèi)化合物是影響中樞神經(jīng)最重要的成分， 其中作用最強(qiáng)的精神活性物質(zhì)是Δ9四氫大麻酚（Δ9Tetrahydrocannabinol， Δ9THC）， 非精神活性的大麻二酚（Cannabidiol， CBD）可以調(diào)節(jié)Δ9THC的欣快效應(yīng)， 大麻酚（Cannabinol， CBN）具有鎮(zhèn)靜和麻醉功效＼[1，2＼]。大麻酚類(lèi)類(lèi)化合物的含量受遺傳、栽培環(huán)境、收獲時(shí)間、儲(chǔ)存條件等因素的影響 ＼[3～5＼]， 根據(jù)以下3種表型指數(shù)， 可將大麻分為毒品型大麻（Ⅰ型）和纖維型大麻（Ⅱ型）＼[2，6～9＼]：（1）依據(jù)Δ9THC含量判斷。若Δ9THC含量>0.3%， 則為毒品型大麻； 若Δ9THC含量<0.3%， 則為纖維型大麻。（2）依據(jù)表型指數(shù)計(jì)算公式（Δ9THC+CBN）/CBD判斷。若表型指數(shù)>1， 則為毒品型大麻； 若表型指數(shù)<1， 則為纖維型大麻。（3）依據(jù)兩個(gè)表型指數(shù)Δ9THC/CBD和CBN/CBD判斷。若兩個(gè)表型指數(shù)之一大于1， 則為毒品型大麻； 而如果兩個(gè)都小于1， 則為纖維型大麻。

目前， 對(duì)大麻酚類(lèi)的分析檢測(cè)方法主要有氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）。氣相色譜分析過(guò)程需要對(duì)大麻樣品進(jìn)行加熱衍生化的前處理， 在此過(guò)程中， 酸性大麻酚類(lèi)會(huì)脫羧成為它們的中性對(duì)應(yīng)物＼[6，8＼]； 液相色譜法則不需要加熱即可直接分析測(cè)定大麻中的酸性和中性大麻酚類(lèi)＼[10～13＼]， 實(shí)現(xiàn)對(duì)大麻植物中組成成分的完整分析。Happyana等采用LCMS方法對(duì)大麻植物中大麻酚類(lèi)成分的分析檢測(cè)， 耗時(shí)40 min＼[1＼]。Ambach等采用HPLCDAD方法， 將時(shí)間縮短至16 min＼[10＼]。本研究的超高效液相色譜采用高壓小顆粒填料， 使分析效率和分離度顯著提高＼[14～17＼]， 同時(shí)借助QDa質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)目標(biāo)物分子信息進(jìn)一步確認(rèn)。利用此技術(shù)， 成功建立了一種可在7 min內(nèi)完成對(duì)大麻植物中3種成分Δ9THC、CBN和CBD檢測(cè)的分析方法（3種大麻酚類(lèi)的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大麻植物化學(xué)表型的分類(lèi)， 為大麻原植物類(lèi)毒品犯罪的緝查及從法庭科學(xué)角度為大麻原植物類(lèi)毒品犯罪的定罪量刑提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC HClass超高效液相色譜儀（Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)， 美國(guó)Waters公司）； ACQUITY光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA， 可操作波長(zhǎng)190～500 nm， 光學(xué)分辨率1.2 nm）和ACQUITY QDaTM質(zhì)譜檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）； 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）； Mettler ToledoXS105電子天平（瑞士Mettler公司）； 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）； 0.22 μm MCE針頭式過(guò)濾器（上海島津技邇商貿(mào)有限公司）。

甲醇（美國(guó)Fisher Scientific公司）、甲酸（美國(guó)Sigma公司）為色譜純； 實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（美國(guó)Millipore公司超純水裝置制備）； Δ9THC、CBD和CBN標(biāo)準(zhǔn)品（均為1.0 mg/mL甲醇溶液， 美國(guó)Cerilliant公司），

Symbolm@@ 20℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確移取Δ9THC、CBD和CBN標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于2 mL容量瓶中， 以甲醇稀釋并定容， 配制成0.5、1、2、5、10和20 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2樣品前處理

選取不同產(chǎn)地的30個(gè)大麻樣本， 經(jīng)登記備案獲批后， 研磨成均勻細(xì)粉待用。準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg大麻植物粉末， 置于15 mL塑料離心管中， 加入甲醇5 mL， 經(jīng)水浴超聲萃取30 min后， 以6000 r/min離心5 min， 取上清液過(guò)0.22 μm針孔濾膜， 供UPLC/PDAQDa分析。

2.3分析條件和數(shù)據(jù)分析

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITYTM UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）； 柱溫35℃； 樣品室溫度為20℃； 進(jìn)樣體積為2 μL； 流動(dòng)相為甲醇（含0.1%甲酸）水（87∶13， V/V）， 等度洗脫， 流速為0.2 mL/min； 在220 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)； 使用10%甲醇溶液清洗密封圈； 運(yùn)行時(shí)間7 min。

質(zhì)譜條件：Waters質(zhì)譜檢測(cè)器QDa， 電噴霧離子源， 掃描質(zhì)量范圍為m/z 100～500 Da。從超高效液相色譜柱流出來(lái)的樣品直接進(jìn)入質(zhì)譜分析， 正離子掃描， 采樣速率10點(diǎn)/s， 毛細(xì)管電壓為0.8 kV， 錐孔電壓為30 V， 探頭溫度為600℃。

利用Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到3種大麻酚類(lèi)化合物的含量數(shù)據(jù)， 采用SIMCAP11.5 （Umetrics AB， Umea， Sweden）軟件作主成分分析， 通過(guò)得分圖獲得不同產(chǎn)地大麻樣本的分型信息。

3結(jié)果與討論

3.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化前處理?xiàng)l件， 實(shí)驗(yàn)選用甲醇作為提取劑， 以超聲方式進(jìn)行萃取， 考察了不同萃取時(shí)間（15、 30和45 min）和萃取次數(shù)（1和2次）對(duì)大麻酚類(lèi)提取效率（峰面積）的影響。最終采用30 min超聲1次的條件， 第1次提取后， 各目標(biāo)物峰面積均達(dá)到兩次提取各目標(biāo)物峰面積之和的95%以上。

3.2 UPLC/PDAQDa條件的選擇

為改善峰形， 本實(shí)驗(yàn)嘗試在甲醇中加入0.1%甲酸溶液， 采用甲醇水（87∶13， V/V）等度洗脫時(shí)， 不僅能達(dá)到較好的分離效果， 且分離時(shí)間較短， 目標(biāo)分析物可在4 min內(nèi)流出色譜柱。為避免天然產(chǎn)物中組分眾多可能存在的樣品間干擾， 將分離檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)至7min。采用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件， 對(duì)大麻混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及大麻植物樣品溶液檢測(cè)， 3種目標(biāo)大麻酚類(lèi)化合物的色譜圖見(jiàn)圖2。

3.3UPLC方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1方法的專(zhuān)屬性在方法建立期間， 通過(guò)優(yōu)化峰間距并增大分離度， 保證峰的專(zhuān)屬性。CBD、CBN和Δ9THC的保留時(shí)間分別為1.1、1.6和1.9 min， 各成分與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.6， 拖尾因子在1.16～1.23之間。同時(shí)， QDa檢測(cè)器作為光學(xué)數(shù)據(jù)的補(bǔ)充， 具有更高質(zhì)量的定性質(zhì)譜數(shù)據(jù)， 可對(duì)組分進(jìn)行進(jìn)一步確證。在正離子模式下掃描， 根據(jù)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的碎片離子質(zhì)譜圖分析， Δ9THC、CBN和CBD的m/z分別為315、311和315。分別在m/z 315和311下提取離子流質(zhì)譜圖， 對(duì)大麻樣本的洗脫峰進(jìn)行比對(duì)分析。圖3和圖4是利用質(zhì)譜檢測(cè)器QDa對(duì)Δ9THC、CBN和CBD各峰的追蹤確證結(jié)果， 與PDA檢測(cè)分析一致， 且無(wú)基質(zhì)干擾。在選定實(shí)驗(yàn)條件下， 所測(cè)的3個(gè)大麻酚類(lèi)組分與其它組分完全分離， 滿足含量測(cè)定要求。

3.3.2線性關(guān)系、檢出限和定量限配制3種大麻酚類(lèi)化合物濃度分別為0.5～20.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 按照上述條件進(jìn)行檢測(cè)分析。以各分析物的峰面積Y為縱坐標(biāo)， 濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 進(jìn)行線性回歸分析。采用向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度的方法確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）， 按照信噪比S/N≥3和S/N≥10分別計(jì)算檢出限和定量限。3種大麻酚類(lèi)化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢出限見(jiàn)表1， 在0.5～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)， 3種大麻酚類(lèi)化合物線性關(guān)系良好（R≥0.999）， 可滿足定量分析的要求。

3.3.3準(zhǔn)確度和精密度向已知含量的大麻樣品中分別添加低、中、高濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品，

每個(gè)濃度水平做6次平行實(shí)驗(yàn)， 進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)， 評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。同時(shí)， 對(duì)每個(gè)濃度水平在一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次， 連續(xù)測(cè)定6天， 評(píng)價(jià)方法的日內(nèi)精密度（Intraday precision）和日間精密度（Interday precision）。由如表2可知， 3種大麻酚類(lèi)化合物的加標(biāo)回收率范圍為82%～102%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%， 表明本方法精確可靠， 重復(fù)性良好。

3.4實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法測(cè)定不同產(chǎn)地的大麻植物樣本中 3種大麻酚類(lèi)化合物的含量， 依據(jù)不同的表型指數(shù)計(jì)算公式對(duì)樣本進(jìn)行化學(xué)表型劃分， 結(jié)果見(jiàn)表3。

受遺傳特征、栽培環(huán)境、收獲時(shí)間、儲(chǔ)存條件等因素的影響， 大麻植物樣本中3種大麻酚類(lèi)化合物的含量有很大差異。在許多國(guó)家， 大麻種植被認(rèn)為是非法的， 而在允許種植的國(guó)家中， 需要測(cè)試栽培品種中精神活性物質(zhì)Δ9THC的含量需低于法律允許下限。在歐洲， 允許種植的大麻， 其Δ9THC最大含量為干物質(zhì)重量的0.2%或0.3%， 以此作為國(guó)家規(guī)定限度＼[11＼]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的大麻植物樣本中Δ9THC、CBN和CBD含量變化范圍分別在0.026%～1.44%、0.006%～3.33%和0.006%～3.84%之間。根據(jù)含量結(jié)果判斷， 表3中有12個(gè)大麻樣本的Δ9THC含量大于0.3%， 可歸為毒品型大麻。

據(jù)文獻(xiàn)＼[4＼]報(bào)道， 由于對(duì)熱和光的不穩(wěn)定性， 大麻植物樣品中的Δ9THC濃度會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。考慮到檢材中大麻酚類(lèi)受環(huán)境等因素造成的含量變化， 可以3種大麻酚類(lèi)化合物的相對(duì)組成含量判斷化學(xué)表型。以表型指數(shù)（2）進(jìn)行樣本分型， 有17個(gè)樣本被歸為毒品型， 其中有9個(gè)樣本的Δ9THC含量均低于0.3%， 但仍歸為毒品型大麻。表型指數(shù)（3）是對(duì)表型指數(shù)（2）的拆分， 據(jù)此分型， 得到判斷與表型指數(shù)（2）的結(jié)果一致。

3.5基于主成分分析的分型研究

主成分分析（Principal component analysis， PCA）通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理后， 可以直觀顯示各組樣品的差異＼[18～20＼]。以大麻樣本中Δ9THC、CBN、CBD的含量為變量， 作主成分（PCA）分析， 將黑龍江、內(nèi)蒙古、新疆和陜西4個(gè)產(chǎn)地大麻樣本的30組含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP軟件， 將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PCA分析， 3種大麻酚類(lèi)化合物的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到94.4%， 所得的載荷圖如圖5所示， 不同產(chǎn)地的大麻樣本被分為2類(lèi)即毒品型和纖維型大麻， 按照3種大麻酚類(lèi)化合物的影響進(jìn)行分類(lèi)， 獲得與表型指數(shù)（1）吻合的分型結(jié)果。

4結(jié) 論

本研究采用光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器與質(zhì)譜檢測(cè)（QDa）技術(shù)聯(lián)用， 建立了同時(shí)測(cè)定大麻植物中3種大麻酚類(lèi)化合物含量的超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析方法， 可對(duì)3種大麻酚類(lèi)實(shí)現(xiàn)色譜的快速分離及質(zhì)譜的追蹤確證。利用本方法對(duì)不同產(chǎn)地的大麻植物樣本進(jìn)行含量分析， 并對(duì)利用不同的表型指數(shù)和主成分分析判斷大麻植物的化學(xué)表型進(jìn)行了探討， 為監(jiān)測(cè)和打擊毒品型大麻的非法種植提供了高通量快速檢測(cè)方法和判斷依據(jù)。

References

1Happyana N， Agnolet S， Muntendam R， Dam V， Schneider B， Kayser O. Phytochemistry， 2013， 87： 51-59

2BenjaminD B， Kevin M， Alain G V， Corinne C. J. Forensic sci.， 2012， 57（4）： 918-922

3Turner C E， Hadley K W， Fetterman P S， Doorenbos N J， Quimby M W， Waller C. Journal of Pharmaceutical Sciences， 1973， 62（10）： 1601-1605

4Trofin I， Vlad C， Dabija G， Filipescu L. Revista de Chimie， 2011， 62（6）： 639-645

5Fairbairn J W， Liebmann J A， Rowan M G. J. Pharmacy Pharmacol.， 1976， 28： 1-7

6Tipparat P， Natakankitkul S， Chamnivikaipong P， Chutiwat S. Forensic Sci. Inter.， 2012， 215： 164-170

7Stefanidou M， Dona A， Athanaselis S， Papoutsis I， Koutselinis A. Forensic Sci. Inter.， 1998， 95： 153-162

8Pellegrini M， Marchei E， Pacifici R， Pichini S. J. Pharmaceut. Biomed. Anal.， 2005， 36： 939-946

9Oliveira G L， Voloch M H， Sztulman G B， Neto O N， Yonamine M. Forensic Toxicol.， 2008， 26： 31-35

10Ambach L， Penitschka F，Broillet A， Knig S， Wolfgang W， Bernhard W. Forensic Sci. Inter.， 2014， 243： 107-111

11Backer B D， Debrus B， Lebrun P， Theunis L， Dubois N， Decock L， Verstraete A， Hubert P， Charlier C. J. Chromatogr. B， 2009， 877： 4115-4124

12Gambaro V，Acqua L D， Farè F， Froldi R， Saligari E， Tassoni G. Anal. Chim. Acta， 2002， 468： 245-254

13Peschel W， Politi M. Talanta， 2015， 140： 150-165

14ZHANG Gang， GUO JiangNing， BI KaiShun. Journal of Shenyang Pharmaceutical University， 2003， 34（5）： 269-271

張 崗， 郭江寧， 畢開(kāi)順. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 34（5）： 269-271

15ZHANG AiZhi， WANG QuanLin， MO ShiJie. Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（11）： 1015-1019

張愛(ài)芝， 王全林， 莫世杰. 色譜， 2010， 28（11）： 1015-1019

16ZHANG AiZhi， WANG QuanLin. Food Science， 2011， 32（10）： 194-198

張愛(ài)芝， 王全林. 食品科學(xué)， 2011， 32（10）： 194-198

17Waseem G， Shahbaz W G， Mohamed M R， Amira S W， Zlatko M， Ikhlas I K， Maged H S， Mahmoud A E. J. AOAC Inter.， 2015， 98（6）： 1523-1528

18SIRI Guleng， LIU XiaoLing， LI TongMei， SHI LuWen. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 675-681

斯日古楞， 劉小玲， 李冬梅， 史錄文. 分析化學(xué)， 2015， 43（5）： 675-681

19LI Xue， PI ZiFeng， XING JunPeng， LIN Na， LIU ZhiQiang， SONG FengRui. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（11）： 1646-1650

李 雪， 皮子鳳， 邢俊鵬， 林 娜， 劉志強(qiáng)， 宋鳳瑞. 分析化學(xué)， 2014， 42（11）： 1646-1650

20ZENG MaoMao， LI Yang， HE ZhiYong， QIN Fang， CHEN Jie. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（1）： 71-76

曾茂茂， 李 洋， 何志勇， 秦 昉， 陳 潔. 分析化學(xué)， 2014， 42（1）： 71-76