小麥自噬相關因子ATG5的原核表達和抗血清制備

張加姿 李開心 于寶佳 岳潔瑜 王華忠

（天津師范大學生命科學學院 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

研究報告

小麥自噬相關因子ATG5的原核表達和抗血清制備

張加姿 李開心 于寶佳 岳潔瑜 王華忠

（天津師范大學生命科學學院 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

細胞自噬在植物生長發育和環境響應中扮演了重要角色，ATG5是參與自噬小體組裝的核心因子之一。在前期工作中我們克隆了兩個小麥ATG5基因TaATG5a和TaATG5b，并對其開展了初步的功能分析。鑒于后續基因功能研究中的免疫學方法涉及對特異性抗體的需求，通過載體構建、原核表達和親和層析過程獲得了TaATG5a的重組蛋白，經兔免疫過程制備了TaATG5a的抗血清，采用ELISA和Western雜交等方法鑒定了抗體的效價和特異性。結果表明，克隆于pET30a載體上的TaATG5a在大腸桿菌中能夠被IPTG高效誘導表達，重組蛋白的表觀分子量與理論值基本一致，表達量在誘導0-8 h范圍內逐漸增加。純化的重組蛋白純度較高，滿足抗體制備要求。制備的抗血清能特異性識別原核表達和小麥內源的TaATG5a，效價達到1∶25 600。此外，制備的抗血清通過Western雜交還能夠識別共價連接的小麥ATG12-ATG5復合物，該復合物是小麥葉片中ATG5的主要存在形式。

小麥；自噬相關因子ATG5；原核表達；抗血清

細胞自噬（Autophagy，后文稱為自噬）是一種重要的 真核生物細胞內膜泡運輸過程，負責細胞質物質的靶向液泡（動物是溶酶體）運輸和分解。在自噬過程中，待分解物質被雙層結構的膜泡包裹形成自噬小體；隨后自噬小體外膜與液泡膜融合，藉此將內膜及包裹的物質（自噬小泡）送入液泡［1，2］。自噬小體的組裝及與液泡的融合等過程是在包括ATG5在內的一系列自噬相關因子（Autophagy-related，ATG）參與下實現的。在有關ATG5參與自噬的角色中，研究得最清楚的是其以共價連接的ATG12-ATG5形式與ATG16形成復合物（ATG12-ATG5·ATG16）4，該復合物催化ATG8與脂類分子磷脂酰乙醇胺（PE）的連接，藉此將ATG8定位于自噬膜表面［3，4］，ATG8在自噬膜的起始、延伸、合攏及與液泡的融合等過程中發揮重要作用［5，6］。此外，植物ATG5還表現出在早期吞噬泡開口處的環形定位特征，可能參與自噬膜從內質網表面的起始、擴展及閉合等過程［7］。需要注意的是，對動物的研究發現還存在另一類不依賴于ATG5的自噬途徑［8，9］。除參與自噬核心過程外，ATG5還具有非自噬或在自噬與其他細胞過程之間建立聯系的功能，如動物ATG5參與了抗病毒免疫信號的抑制［10］和細胞凋亡的促進［11］，在DNA損傷劑作用下表現轉位到核內促進有絲分裂異常現象的作用［12］。自噬的分子機制研究始于酵母，后來發現其在包括動植物在內的真核生物中非常保守，動植物含有包括ATG5在內的大部分酵母ATG的同源基因［13-15］。鑒于ATG5在自噬中的重要作用及其有別于其他ATG因子的功能多樣性，以ATG5為靶標深入探索其參與的自噬及其他細胞過程的機制和生理功能具有重要意義。

自噬參與了植物的正常生長、發育和衰老等過程，也與植物適應環境的生理過程密切相關［16-18］。此前本實驗室先后報道了重要農作物小麥ATG4、ATG6、ATG8、ATG10和ATG18的鑒定，發現小麥對生物、非生物脅迫的響應過程涉及對自噬水平的調控［19，20］。本實驗室目前也已經克隆了兩個小麥ATG5基因TaATG5a（KF294799）和TaATG5b（KF294800），表達分析和基因沉默研究結果初步表明其參與了小麥的自噬和逆境脅迫響應等過程（未發表數據）。鑒于后續的基因功能研究工作涉及免疫學方法和對特異性抗體的需求，本研究利用原核表達和蛋白純化方法獲得了小麥TaATG5a的重組蛋白，制備了重組蛋白的抗血清。利用ELISA和Western雜交方法分析了抗血清對抗原識別的特異性和效價，鑒定了小麥內源ATG5的存在形式。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pET30a質粒、克隆有小麥TaATG5a基因的pLB-ATG5a載體質粒、大腸桿菌菌株 DH5α和 BL21（DE3）由本實驗室保存。限制性核酸內切酶NotⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒（CW0894S）、ECL化學發光檢測試劑盒（CW0049S）和辣根過氧化物酶底物TMB溶液（CW0050S）購自康為世紀生物科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗式不完全佐劑購自美國 Sigma-aldrich 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG由北京華大蛋白質研發中心有限公司提供。其他生化試劑均為進口或國產分析純試劑。構建載體的DNA 測序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體的構建 設計合成兩端添加NotⅠ識別位點的PCR引物對5aNOTI-F（ATAAGAATGCGGCCGCACGGCGCGAGCAATG）/5aNOTI-R（ATAAGAATGCGGCCGCTCATGCCCCAACGTA），使用高保真pfu DNA聚合酶從pLB-ATG5a上擴增TaATG5a的全長ORF。擴增片段經電泳、回收和NotⅠ酶切后連接于原核表達載體pET30a的相應切點處，經測序鑒定插入方向正確的重組表達載體pET-ATG5a。提取載體質粒并將其導入到大腸桿菌表達菌種BL21（DE3）中。

1.2.2 原核表達 將含有pET-ATG5a的菌種BL21（DE3）劃線接種于固體LBK培養基（含50 mg/L卡那霉素的LB）表面，過夜培養至長出單克隆。挑取單克隆接種于LBK 液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。將培養物按1%的比例擴大到5 mL 相同培養基中，37℃繼續振蕩培養至對數生長期（OD600約為0.6-0.8）。加入終濃度為500 μmol/L的IPTG，于28℃條件下震蕩培養誘導目標基因的表達。分別于誘導后0、2、4、6和8 h 取1 mL 菌液用于總蛋白的SDS-PAGE分析。1.2.3 重組蛋白的純化 重組蛋白為N 端含組氨酸標簽的His（6）-TaATG5a，因此使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒在非變性條件下純化重組蛋白。菌體超聲破碎、層析柱平衡、蛋白上樣及雜蛋白清洗等過程參照試劑盒手冊進行。使用從低到高的咪唑濃度梯度洗脫液分段洗脫目標蛋白。對收集的各管洗脫液取20 μL進行SDS-PAGE分析。根據電泳結果混合目標蛋白較純、含量較高的洗脫液。

1.2.4 抗血清制備和效價檢測 將純化的重組蛋白（抗原）溶液與等體積的弗氏佐劑（初次免疫）或弗氏不完全佐劑（加強免疫）完全混合形成油包水的免疫原。對新西蘭大白兔進行背部皮下注射免疫，打8-10個點。初次免疫1次，400 μg抗原；此后每10-15 d加強免疫1次，共3次，每次200 μg抗原。取免疫兔子的頸動脈血，室溫靜置2 h，5 000 r/min離心10 min后收集多抗血清，-20℃保存。以免疫前收集的耳靜脈血清作為陰性血清對照。

采用ELISA法對抗血清（一抗）進行抗原結合特異性鑒定和效價測定。對一抗從200倍開始使用PBS進行2倍梯度稀釋，空白對照為PBS，陰性對照為陰性血清200倍稀釋液。以純化的His（6）-TaATG5a重組蛋白為抗原包被酶標板，包被好的酶標板經脫脂奶粉封閉、一抗結合、洗滌、二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋度）結合和洗滌等步驟后，加入含H2O2的底物TMB溶液顯色10 min，再加入2 mol/L的H2SO4終止反應，于450 nm波長處測定并記錄吸光值。

1.2.5 Western雜交 大腸桿菌或小麥葉片總蛋白經SDS-PAGE分離和半干轉印過程轉印至PVDF膜上。轉印膜經脫脂奶粉封閉、一抗（1∶2 000稀釋度）結合、洗滌、二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋度）結合和洗滌等步驟后，使用ECL化學發光檢測試劑盒試劑在化學發光成像系統（ChemiDocXRS+，BioRad）中進行雜交信號的檢測和拍照。

2 結果

2.1 小麥TaATG5a的原核表達

構建了小麥TaATG5a的原核表達載體pETATG5a。28℃震蕩培養條件下，在含有該表達載體的大腸桿菌BL21（DE3）培養物中加入IPTG誘導目標基因表達。如圖1所示，經IPTG 誘導后的大腸桿菌總蛋白中出現重組蛋白His（6）-TaATG5a條帶，表達量在誘導0-8 h范圍內隨時間的延長逐漸增加，在誘導8 h后達到最高。帶有His（6）標簽的重組蛋白表觀分子量與理論值（47.6 kD）基本一致。

圖1 小麥TaATG5a基因的原核表達

2.2 小麥TaATG5a重組蛋白的純化

采用Ni 柱親和層析方法從經IPTG誘導8 h的大腸桿菌總蛋白中純化重組蛋白His（6）-TaATG5a。重組蛋白掛柱后，使用咪唑濃度逐漸升高的洗脫液進行洗脫。如圖2所示，隨著洗脫液中咪唑濃度的升高，雜蛋白含量逐漸減少，目標重組蛋白含量逐漸增加。300 mmol/L咪唑洗脫液中重組蛋白的純度較高，滿足抗體的制備要求。

圖2 原核表達小麥TaATG5a重組蛋白的純化

2.3 小麥TaATG5a抗血清的制備和效價測定

以純化的重組蛋白His（6）-TaATG5a作為免疫原，經兔免疫方法獲得了TaATG5a的抗血清。Western雜交和ELISA實驗結果表明，抗血清能特異性識別原核表達的TaATG5a，證實抗血清中特異性抗體的存在（圖3-A和3-B）。Western雜交結果還表明，導入大腸桿菌中的TaATG5a在加入誘導物IPTG之前既有低水平的表達（圖3-A的泳道3），而這種低水平的表達不能被考馬斯亮藍染色檢測到（圖3-A的泳道1）。ELISA實驗結果中，如以OD值為陰性孔2.1倍的最大稀釋度作為抗血清效價，制備的抗血清效價達到1∶25 600（圖3-B），滿足Western雜交、免疫沉淀等實驗對抗體特異性和效價的要求。

圖3 抗血清對原核表達TaATG5a重組蛋白的識別

使用制備的抗血清對小麥葉片總蛋白進行Western雜交，結果出現兩條清晰的雜交帶（圖4）。分子量相對較小的帶的表觀分子量與TaATG5a理論值（40.8 kD）接近，分子量相對較大的帶的表觀分子量與共價連接的ATG12-ATG5理論值（51.2 kD）接近。因此，初步判斷較小的帶來自游離形式的TaATG5a及其他六倍體小麥中含有的與TaATG5a大小相近且高度相似的同源蛋白，較大的帶來自共價連接的ATG12-ATG5復合物。從雜交信號強度來看，小麥葉片中的ATG5主要以共價連接的ATG12-ATG5形式存在。

圖4 利用Western雜交方法鑒定抗血清對小麥內源TaATG5a的識別

3 討論

酵母的自噬分子機制研究于2016年獲得諾貝爾生理醫學獎，近年來有關高等動植物的自噬機制和生理功能研究方興未艾。細胞通過自噬過程清除衰老、變性的細胞器、大分子及入侵的病原，藉此維持細胞穩態、協調能量供給、調節信號通路、調控細胞死亡以及響應環境中的生物和非生物脅迫。植物上，已發現自噬與植株正常生長、發育、代謝、衰老以及響應營養缺乏、高鹽、干旱、氧化、淹水和病原菌侵染等逆境脅迫過程密切相關。ATG5是參與自噬小體組裝的重要因子之一，因而也是植物上開展自噬分子機制和生理功能研究的主要目標基因之一［16-18］。此前本實驗室對兩個小麥ATG5基因TaATG5a和TaATG5b開展了表達分析和基因沉默等DNA和RNA水平的研究，結果初步表明其參與了小麥的自噬和逆境脅迫響應等過程。后續的基因功能解析工作將涉及蛋白水平的Western雜交和免疫共沉淀等免疫學方法，目標蛋白特異性抗體的獲得是開展此類方法研究的必備條件之一。

普通小麥是六倍體物種，含有A、B 和D三個同源染色體組，對應二倍體物種的每個基因在普通小麥內通常都以3個多倍體同源基因（Homeolog）的家族形式存在。家族成員蛋白往往大小相近且序列高度相似，以其中一種蛋白全長肽鏈為抗原制備的多抗往往會與其他蛋白產生交叉反應，難以將它們區分開。小麥TaATG5a和TaATG5b的序列長度相同且相似性達到96%，基因的染色體定位結果也表明了他們的多倍體同源關系（未發表數據），選擇TaATG5a或TaATG5b制備的多抗血清在Western雜交中應該能夠同時識別小麥總蛋白中每個ATG5家族成員。鑒于此，本研究選擇小麥TaATG5a為抗原，通過原核表達載體構建、IPTG 誘導表達和親和層析過程獲得了TaATG5a的重組蛋白，使用重組蛋白作為免疫原制備了兔源的TaATG5a抗血清。ELISA和Western雜交實驗結果表明，制備抗血清中的多抗能特異性識別原核表達和小麥內源的TaATG5a、效價較高，為今后在小麥上通過免疫學方法深入研究ATG5和自噬的功能、篩選鑒定ATG5互作蛋白等工作奠定了基礎。此外，使用制備的抗血清通過Western雜交還能夠鑒定共價連接的小麥ATG12-ATG5復合物，而且結果顯示此復合物是小麥ATG5的主要存在形式，與擬南芥和動物ATG5存在形式的報道一致［23，24］。

4 結論

利用原核表達和蛋白純化方法獲得了小麥TaATG5a的重組蛋白，制備了重組蛋白的抗血清。抗血清能特異性識別TaATG5a，效價達到1∶25 600。制備的抗血清還能夠識別共價連接的小麥ATG12-ATG5復合物，該復合物是小麥葉片中ATG5的主要存在形式。

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（責任編輯 朱琳峰）

Prokaryotic Expression of Wheat Autophagy-related Factor ATG5 and Preparation of Its Antiserum in Rabbits

ZHANG Jia-zi LI Kai-xin YU Bao-jia YUE Jie-yu WANG Hua-zhong
（Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，School of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Autophagy is closely implicated in plant growth and development，as well as responses to environmental stimuli. ATG5 is one of the core factors involved in autophagosome assembly. Two wheat ATG5-encoding genes，TaATG5a and TaATG5b were cloned previously and are under deep functional study in our lab. In order to meet the need of specific antibodies in immunological methods used in further functional gene and protein study，a recombinant protein TaATG5a was acquired by vector construction，prokaryotic expression，and purification via the Ni-column affinity chromatography method，then the antiserum was prepared in rabbit immunization. The titer and specificity of the prepared antiserum were tested by the ELISA and Western blot assays. The results showed that the expression of TaATG5a cloned in vector pET30a was efficiently induced in Escherichia coli by IPTG，and gradually increased with the extension of IPTG induction time over 0 - 8 h. The apparent molecular weight of recombinant protein TaATG5a was close to its theoretical value. The purified recombinant protein was in high-purity that satisfied the requirements for antibody preparation. The prepared antiserum had a high titer of 1∶25 600 and specifically recognized TaATG5a in E. coli or wheat total protein. In addition，the ATG12-ATG5 in conjugated form，i.e.，the main form of wheat ATG5 in leaves，was also recognized by the prepared antiserum through Western blot assay.

wheat；ATG5；prokaryotic expression；antiserum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0020

2017-01-20

天津市自然科學基金項目（17JCZDJC33800），天津師范大學創新基金（52XC1604）

張加姿，女，碩士，研究方向：植物遺傳學；E-mail：15900331537@163.com

王華忠，男，博士，教授，研究方向：植物遺傳學；E-mail：skywhz@mail.tjnu.edu.cn