青香蕉蘋果MdAFS基因序列與表達模式分析

王茹茹 鄧帥 丁瑞瑞 趙榮榮 張元湖

（山東農業大學生命科學院 作物生物學國家重點實驗室，泰安 271018）

青香蕉蘋果MdAFS基因序列與表達模式分析

王茹茹 鄧帥 丁瑞瑞 趙榮榮 張元湖

（山東農業大學生命科學院 作物生物學國家重點實驗室，泰安 271018）

以青香蕉蘋果葉片為材料，研究青香蕉蘋果 ‘White Winter Pearmain’ α-法尼烯合酶（α-farnesene synthase，MdAFS）全長基因結構特征及編碼蛋白質性質，分析MdAFS基因的誘導表達模式。采用生物信息學軟件對 MdAFS 及其編碼蛋白質進行詳細分析，應用MEGA 6.0對不同物種來源的AFS構建系統進化樹，利用 qRT-PCR技術研究MdAFS誘導表達模式。α-法尼烯合酶基因（GenBank No：AY563622）全長1 731 bp，由576氨基酸組成，是 α螺旋為主要構成元件的混合型蛋白。不同物種的α-法尼烯合酶氨基酸序列相似度低，但α-法尼烯合酶N端RRx8W和C端的H-α1loop具有高度保守性。非生物脅迫和激素信號能誘導MdAFS基因上調表達，且MV、ABA和MeJA誘導該基因上調表達更加明顯。α-法尼烯合酶氨基酸序列相似度低，但蛋白三維結構相似；α-法尼烯合酶在蛋白結構和功能上具有單萜合酶特征，初步揭示了非生物脅迫和激素信號能誘導青香蕉蘋果α-法尼烯代謝途徑的關鍵酶MdAFS基因上調表達。

青香蕉蘋果；α-法尼烯合酶；倍半萜揮發物；非生物脅迫；表達分析

倍半萜是萜類化合物中種類最多的一類，目前已發現約5 000多種，它是一類普遍脅迫誘導的植物揮發性物質［1，2］。α-法尼烯是一種含共軛二雙鍵的倍半萜化合物，最早在蘋果果皮中發現，并發現在植物防御中扮演著重要 角色，是植物受到植食性害蟲侵食或病原菌侵染揮發出的防御性物質或吸引害蟲天敵的信號物質之一［3-6］。例如，蘋果被蠹蛾侵染后能產生大量的α-法尼烯且能吸引新生幼蟲［7］；在病原菌敏感大豆中過表達α-法尼烯合酶能增強植物抗菌性［8］。α-法尼烯最初被關注是20世紀初，它的氧化產物被認為與蘋 果和梨果實在低溫儲藏后期常見的一種生理性病害虎皮病有關［9］。近年來，α-法尼烯等含有共軛二雙鍵的揮發性 萜類化合物被認為參與植物抵御非生物脅迫，如溫度、光和氧化脅迫等。其作用機制為，當植物受到非生物脅迫時會積累活性氧，單萜和倍半萜揮發性萜類化合物在非生物脅迫下，釋放量增加，通過它們共軛二雙鍵的斷裂清除活性氧，穩定膜結構增強植物抵御逆境脅迫（如強光，氧化脅迫）；它也能耗散作用于光合膜光剩光能，溶于細胞膜提高植物的耐熱性，從而緩和植物受到的傷害［10-13］。

植物萜類代謝主要存在兩條途徑，即發生在胞質中主要合成倍半萜和甾醇的甲羥戊酸途徑（MVA）與存在質體中主要合成單萜和二萜的3-磷酸甘油醛/丙酮酸途徑（MEP）［14，15］。α-法尼烯是通過萜類代謝途徑的甲羥戊酸途徑產生［16，17］，α-法尼烯合酶是α-法尼烯生物合成途徑的一個關鍵酶，它通過催化法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）合成α-法尼烯，是α-法尼烯合成途徑的終端酶。據報道α-法尼烯合酶是一種單萜/倍半萜底物合酶，它能利用牦牛兒基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP）合成單萜，利用FPP合成倍半萜，而且它還具有異戊烯基轉移酶特性，能直接利用GPP和異戊烯基焦磷酸（IPP）［18］。這種利用多底物的特性能 使一種萜類合酶產生多種萜類化合物，被認為對植物生長發育過程中適應環境有重要意義［19］。目前已有多篇文獻對不同品種蘋果的α-法尼烯合酶基因結構或蛋白特點進行了分析［20-25］，例如，Pechous和李萌等［20，21］主要對蘋果α-法尼烯合酶酶活性特征進行了分析；苑克俊和Beuning等［22，23］分析了蘋果α-法尼烯合酶基因組結構特征；Green等［24，25］則對蘋果α-法尼烯合酶蛋白與底物結合特征進行了分析。但是，不同物種α-法尼烯合酶之間序列同源比對與聚類分析和蘋果α-法尼烯合酶不同誘導表達模式分析并未見詳細報道。本研究對前期獲得的虎皮病敏感品種青香蕉蘋果MdAFS蛋白進行了生物信息學分析。同時以野生型青香蕉蘋果葉片為材料，對α-法尼烯合酶進行不同非生物脅迫和激素信號處理并取材，研究非生物脅迫與激素信號等對該基因表達模式的影響，初步揭示MdAFS基因對非生物脅迫和信號處理的響應。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果品種為‘青香蕉’，由泰安市郊區果園提供。以其春天新生完全展開的葉片為材料，取離體‘青香蕉’蘋果葉片置于培養皿中，分別進行乙烯（ETH，50 mg/L）、脫落酸（ABA，100 μmol/L）、茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol/L）、水楊酸（SA，500 μmol/L）、甲基紫精（MV100 μmol/L）、強光（1 200 μmol m-2s-1）、高溫（45℃）、低溫（4℃）等誘導處理，除強光、高溫、低溫處理外其他處理均為25℃光照培養箱中進行，并以蒸餾水處理作為對照，在0、2、4、6、8和10 h取樣，取樣 后立即進行液氮速凍并于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 青香蕉蘋果AFS基因的cDNA序列的信息學分析 氨基酸序列的同源性分析用NCBI BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM =blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_ LOC=blasthome）。應用GOR4在線軟件（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4. html）對MdAFS蛋白的二級結構進行預測和分析，利用SMART在線軟（http://smart.embl-heidelberg. de/）分析蛋白質的結構域，采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質結構域的三維建模。然后利用MEGA 6.0軟件，算法為Neighbor-Joining，自檢舉1 000次，構建系統發育進化樹。

1.2.2 實時熒光定量PCR 用北京天根公司多糖多酚總RNA提取試劑盒，提取不同處理青香蕉蘋果葉片的總RNA，并用該公司的反轉錄試劑盒DNaseⅠ去除DNA污染，反轉錄為cDNA，用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix（康為世紀，北京）進行實時熒光定量PCR，PCR 程序為95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個循環，溶解曲線的溫度是65-95℃。所用的內參引物為Actin（F：5'-CACTGGTCGTACAACTGGTAT-3'，R：5'-AGGTAGCTCATAGCTCTTCTC-3'，GenBank No：XM_008393049），定量引物pAFS（F：5'-AAAGCGACAATCTCGGCACAA-3'，R：5'-GCGCGAAATGGTGGTTCTCTAAT-3'）基因的相對表達量分析用2-△△CT法。

2 結果

2.1 AFS的蛋白二級結構預測與分析

蛋白質二級結構通常包括α-螺旋、β-轉角、β-折疊、延伸鏈和無規則卷曲等基序。通過應用GOR4在線軟件對MdAFS蛋白質二級結構預測分析，發現MdAFS基因的二級結構元件主要由α-螺旋（47.05%）、延伸鏈（16.15%）和無規則卷曲（36.81%）構成（圖1）。根據H與E占總序列百分比比例，可知MdAFS蛋白屬于混合型［26］。

由SWISS-MODEL Workspace在線軟件建立MdAFS蛋白的三維結構模型（圖2）。

圖1 MdAFS基因的蛋白質二級結構預測

圖 2 MdAFS蛋白的三維結構模型

2.2 不同物種法尼烯合酶同源性比對及進化分析

通過BLASTP選取與MdAFS基因編碼蛋白相似性較高的9條AFS蛋白序列，砂梨ACC 94157.1；梅XP_008224883.1；草莓XP_004309672.1；桑EXB31406.1；楊XP_010999554.1；蓖麻AEQ27768.1；可可樹EQY28527.1；葡萄XP_002264134.2；桉樹XP_010054439.1。該蘋果的AFS與薔薇科植物砂梨的AFS同源性較高，達到97%。但與其他物種的同源性均低于70%。利用DNAMAN對這10條氨基酸序列進行比對（相似水平≥75%），結果（圖3）表明，這些氨基酸序列雖然相似度不高，但是在萜類合酶特有保守結構域區域RXR，DDXXD和NSE/DTE高度保守。而且，它們的N端RRx8W和C端的H-α1loop也具有高度保守性。利用MEGA6軟件對它們進行系統進化樹分析（圖4），相同功能的酶之間基因的進化與植物進化具有一定的正相關性，薔薇科的幾個不同植物來源的AFS親緣關系較近，但與其他物種的親緣關系比較遠，MdAFS和砂梨的親緣關系最近，屬于同一個進化支，與梅，草莓親緣關系較近，同屬于同一進化分支。

圖 3 MdAFS 與其他物種的 AFS推導的氨基酸同源性分析

2.3 青香蕉MdAFS基因的非生物脅迫及激素信號誘導

為檢測MdAFS表達對非生物逆境脅迫和激素信號的響應，對青香蕉蘋果葉片進行低溫、高溫、強光、MV、SA、ABA、ETH和MeJA處理，并在處理后不同時間點取樣，以未處理對應時間點作為對照，結果如圖5所示，MdAFS轉錄本在低溫和SA脅迫處理后的表達模式一致，在前8 h表達量相對穩定，8 h后迅速增加并達到峰值（圖5-A、E）。高溫和強光脅迫處理MdAFS基因表達均表現為先升高后下降，最高表達均達10倍以上（圖5-B、C）。MV、ABA、ETH和MeJA處理，MdAFS轉錄均2 h后表現持續上調表達，在6 h表達達到一個相對較高水平（圖5-D、F、G、H）。ETH誘導處理MdAFS雖然表現上調但不顯著，且在6 h后出現略微下調，8 h后又表現為上調表達（圖5-G）。

圖4 10個來自不同物種的AFS氨基酸序列的聚類分析

3 討論

MdAFS氨基酸序列NCBI blast在線分析發現，MdAFS所編碼的蛋白質與除梨外其他物種的AFS蛋白序列相似度比較低，甚至同為薔薇科的相似度也低于70%左右，AFS氨基酸序列的差異性并不影響AFS蛋白三維結構的相似性。2016年報道的大豆AFS蛋白，它的氨基酸序列和蘋果的AFS氨基酸序列相似度只有53%，但是他們分析兩者的蛋白三維結構及保守結構位點發現幾乎完全重疊［8］。對10條不同來源的AFS蛋白氨基酸序列進行同源序列比對發現，盡管序列差異性顯著，但氨基酸序列N端的RRx8W基序和C端的一價陽離子（K+）結合區域H-α1loop具有高度保守性。這與2009年Green研究蘋果α-法尼烯合酶蛋白結構特征的發現相似，即α-法尼烯合酶具有單萜合酶TPS-b和部分TPS-d亞家族特有RRx8W基序［27］和一價陽離子K+結合區的氨基酸序列（RGDxxxI/V）即H-α1loop區域［24］。不同物種的α-法尼烯合酶氨基酸序列同源性不高，早先Pechous和Whitaker［20］研究也發現蘋果的α-法尼烯合酶氨基酸序列與單萜合酶氨基酸序列同源性更高。這可以初步表明，α-法尼烯合酶和單萜合酶在進化上存在聯系。最近的一篇綜述表明，目前已經鑒定出40種萜類合酶（TPSs）具有雙功能或多功能特性，而且80%屬于單萜/倍半萜合酶［19］。Green 等［18］對蘋果α-法尼烯合酶進行體外實驗發現該酶不但能利用FPP為底物合成倍半萜α-法尼烯，也能利用GPP為底物合成單萜β-羅勒烯，進一步證實蘋果α-法尼烯合酶是一種單萜/倍半萜雙功能合酶。已證實擬南芥［28］、葡萄［29］、黃瓜［30］和蘋果［18］等物種的α-法尼烯合酶也都具有單萜/倍半萜雙功能合酶特性，有意思的是，最近分離的大豆α-法尼烯合酶，雖然通過聚類分析也同樣屬于TPSs-b家族且同樣具有RRx8W和H-α1loop結構，但體外實驗發現它卻沒有單萜合酶特性［8］。此外，實驗已經確定蘋果和大豆等α-法尼烯合酶都需要K+和Mg2+輔助因子，但擬南芥α-法尼烯合酶卻只需要Mg2+。早先分離的幾個裸子植物的α-法尼烯合酶，發現屬于TPS-d家族而非TPS-b家族［31］。綜上我們可以推斷α-法尼烯合酶可能由單萜合酶進化而來，并且經過多次進化，在進化過程某些特征出現了丟失。RRx8W和一價陽離子結合區域H-α1loop可能是α-法尼烯合酶所共有的特征性結構序列，可以作為該類萜類合酶的一個分類依據。但這些假設還需要分析其他更多真核雙子葉植物的α-法尼烯合酶得到進一步證明。

植物萜類揮發物是植物的一類防御性代謝物質，植物受到脅迫會伴隨大量的萜類揮發物的釋放。鄧帥等［32］對梨α-法尼烯合酶啟動子序列分析發現它具有脅迫響應元件和激素響應元件。我們對青香蕉蘋果葉片進行非生物脅迫處理以及激素誘導后，MdAFS基因均表現為明顯的上調表達，尤其對氧化脅迫、MeJA和ABA表現更為明顯，說明MdAFS啟動子上也存在響應相關脅迫和激素信號的作用元件。ABA，MeJA以及SA是防御信號物質，植物受到生物與非生物脅迫的時候會引起它們的積累，啟動防御代謝［1，33］。一般認為MVA和MEP途徑代謝受到前體轉錄和蛋白水平的調控，但是近來研究發現環境信號如溫度，光等也反饋調控著萜類代謝［15，34］。MdAFS基因差異表達分析表明非生物脅迫和激素信號調控MdAFS轉錄水平，MdAFS響應非生物和激素誘導信號，可能對于植物迅速有效應答逆境脅迫，緩和植物傷害具有重要意義。但是植物將外界信號通過怎樣的信號轉導通路，需要哪些轉錄因子的介導，還需要更多實驗證明。

圖 5 青香蕉蘋果α-法尼烯合酶基因MdAFS的基因差異表達模式分析

4 結論

本研究對先前獲得的青香蕉蘋果α-法尼烯合酶生物信息學分析表明α-法尼烯合酶各種屬之間的氨基酸序列相似度低于70%，但三維結構和保守結構位點極為相似。α-法尼烯合酶和單萜合酶具有明顯的聯系，且具有明顯的多次進化痕跡。利用實時熒光定量PCR對MdAFS基因在非生物脅迫和激素處理下的表達分析表明，該基因響應非生物脅迫和激素誘導。

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（責任編輯 李楠）

The Sequence and Expression Analysis of MdAFS Gene in‘White Winter Pearmain’ Apple

WANG Ru-ru DENG Shuai DING Rui-rui ZHAO Rong-rong ZHANG Yuan-hu
（State Key L aboratory of Crop Biology，College of Life Science，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018）

This work is to study the full-length gene structural characteristics and encoded protein properties of α-farne sene synthase（MdAFS）from ‘White Winter Pearmain’ apple，and analyze the induced expression patterns of MdAFS gene. Bioinformatics software was used for analyzing the MdAFS gene and its encoded protein，secondary structure，and tertiary structure，then MEGA6.0 for constructing the phylogenetic trees with AFS from different species，and qRT-PCR for studying the expression pattern of MdAFS gene. The full-length of MdAFS gene（GenBank accession number：AY563622）was 1731 bp，contained the complete ORF，encoding 576 amino acids. The prediction analysis of secondary structure and tertiary structure showed that the protein was α-helix as the main parts of the mixed type proteins. The sequence similarity of α-farnesene synthase amino acid in different species was low，but the N-terminal RRx8W and C-terminal the H-α1loop of α-farnesene synthase was highly conservative. Abiotic stress and hormones induced MdAFS expression up-regulated，and more remarkably up-regulated expressions were observed in MV，ABA and MeJA treatments. In conclusion，α-farnesene synthase in ‘White Winter Pearmain’apple has low similarity in amino acid sequence，but similar protein 3D structure. α-farnesene synthase presents monoterpene synthases characteristics in the protein structure and function. It is revealed that the abiotic stress and hormonal signal induce the up-regulation expression of key enzyme MdAFS gene in the α-farnesene metabolic pathway in ‘White Winter Pearmain’ apple.

‘White Winter Pearmain’ apple；α-farnesene synthase；sequiterpen e volatiles；abiotic stress；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0082

2017-02-14

國家自然科學基金項目（31370359）

王茹茹，女，碩士，研究方向：次生代謝與分子調控；E-mail：niceruru@163.com

張元湖，男，博士，研究方向：次生代謝與分子調控；E-mail：yyhzhang@sdau.edu.cn